3.3 原代皮质神经元培养
分离原代大鼠皮质神经元细胞（Primary rat cortical neurons，PCNs），并将其接种于PEI-包被的 E-Plate
96 孔板上，每孔接种的细胞密度不同，接种密度范围为 8000 至 32000 个细胞/孔。如图 3A 所示，PEI
包被不会干扰细胞阻抗的测定。在添加有2% B27 的神经基础培养基中培养 72
小时，原代神经元细胞对细胞培养的条件适应良好。xCELLigence
系统持续监测表明，可能是培养最初的几小时内，细胞贴壁、贴附于培养孔底部，CI 值在培养初期有一定升高。不同细胞密度孔中，通过 PCNs
微管相关蛋白 2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）染色，神经网络的显示非常清楚（参见图
3B）。为去除原代培养的皮质神经元细胞中增殖的胶质细胞，于培养第 3 天，使用 1 µM CAF，对培养的细胞进行处理，共处理 48 小时。如图
3B 所示，CAF-的处理可导致 CI 值轻微降低，极可能是去除增殖的胶质细胞的反映（参见图 3B）。
图 3：原代培养皮质神经元细胞的细胞浓度梯度。
（A） 特定细胞密度下的原代皮质神经元（PCNs）细胞进行培养，使用xCELLigence系统进行持续 6 天的记录。原代分离后， PCNs 用3 天的时间适应细胞培养E-Plate 96 孔板环境。使用 CAF 处理 48 小时，以去除增殖的胶质细胞。然后继续培养 24 小时，以便于细胞恢复。（B） xCELLigence 记录显示CAF-处理对 PCN 细胞的效应。在CAF添加的时间点对细胞效应进行标准化。（C） 不同细胞密度下神经元细胞 MAP-2 的染色图片。
为监测原代培养的神经元细胞的死亡情况（16000 个细胞/孔），使用钙离子载体或谷氨酸盐对细胞进行处理。细胞接种后155 小时后使用钙离子载体处理细胞，发现在添加后5 至6 小时，CI 值显著降低（参见图 4A）。与对照组纺锤状扁平小体相比，暴露于钙离子载体的原代培养细胞可见致密小体的出现（参见图 4）。如图 4B 所示，谷氨酸盐处理后，48 小时至 72 小时期间 CI 值持续下降。尽管谷氨酸盐通过 NMDA 受体的激活，可使细胞内钙离子浓度快速增加，但与钙离子载体处理的细胞相比，后续的细胞死亡时间显著延迟（比较图片 4A 与 4B）。原因可能是，与钙离子载体处理导致的细胞膜完整性的快速丧失以及细胞坏死相比，谷氨酸盐导致细胞死亡信号的激活会稍延迟。与以上发现一致，光学显微镜检查显示，相比与钙离子载体处理的细胞，谷氨酸盐处理的培养神经元细胞形态学改变的程度更小（参见图 4C），这与 xCELLigence 系统的动态记录结果一致。
图 4：原代皮质神经元细胞检测细胞死亡。
（A）于培养第 6 天使用钙离子载体对皮质神经元细胞进行处理，使用 xCELLigence 系统继续监测 3 天。（B）培养第 6 天时，去除生长因子，使用谷氨酸对原代皮质神经元细胞进行处理，继续监测 6-8 天。（C）通过光学显微镜的观察，记录药物对原代皮质神经元细胞的作用。
4 结论
细胞退化与神经细胞死亡通常与急、慢性退化性功能障碍疾病相关，如中风、帕金森症与阿兹海默症。对神经细胞潜在细胞死亡机制的研究是确定神经退化性疾病原因及治疗措施的前提，也是研究人员的兴趣所在。本研究中，我们检测了公认的神经细胞培养模型是否可用于xCELLigence
系统，且是否可进行体外神经毒性与神经保护作用的研究。
研究发现，使用xCELLigence系统可对 HT-22
细胞与原代皮质神经元细胞的神经毒性作用进行持续监测。谷氨酸处理 HT-22
细胞后，可快速启动神经细胞死亡，并导致其发展，因此传统上很难确定进行终点法检测的理想时间点。xCELLigence 通过记录的阻抗 CI
值，实时显示了神经毒性作用，并对何时进行下游蛋白质组学与基因组学终点检测进行了精确定位。而且，通过进行BID抑制剂BI-6C9
在神经防护作用的实验，进一步确定了xCELLigence系统在神经科学抑制剂研究中的适用性。更重要的是，xCELLigence
系统可使我们对整个实验中的原代皮质神经元细胞培养条件进行监测，包括反应板接种、预培养、CAF 处理去除胶质细胞、复合物添加，以及细胞死亡图。
总之，通过 xCELLigence系统，我们可以对神经细胞培养模型，即HT-22
细胞与原代皮质神经元细胞，其细胞培养条件进行监测。我们发现，相比于传统的终点检测，这种新的方法获取的信息更多，同时可降低实验本身及所投入的时间。而且，通过xCELLigence
系统，我们可优化进行终点分析的时间点，并深入研究神经细胞死亡的分子机制。因此，xCELLigence
系统可作为一种非常准确及方便的工具，很好地进行体外神经细胞死亡与神经保护作用研究。
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参考文献
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来源： Sebastian Diemert, Julia Grohm, Svenja,Tobaben, Amalia Dolga, Carsten Culmsee(2010), “Real-Time Detection of Neuronal Cell Death by Impedance-Based Analysis using the xCELLigence System”, Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Werk, Penzberg 82372, Germany