方案一:
带病毒的植物叶、茎、果实、根等粉碎后—20℃冰冻后制成匀浆→用0.5M,PH7.0柠檬酸缓冲液抽提→双层纱布过滤→滤液加入6%PEG(MW6,000)及3%Nacl,充分搅拌40分钟,置冰箱4℃过夜→高速冷冻离心机8×50ml转头,7000rpm,4℃离心20分钟,弃上清,取沉淀→沉淀是浮于0.005M,PH8.5的硼酸缓冲液(含0.05M尿素或1%,Triton
X-100)中,7000rpm,4℃离心20分,取上清液→超速离心:10%~40%蔗糖梯度,日立P40ST转头30,000rpm,4℃离心3小时→每管自上而下收集成30管,每管约400μl,分别做260nm及280nm
O.D.,绘成曲线,收集病毒带(峰前后收集管)。根据260nm及280nm的O.D.值的比值估计样品的纯度
方案二:
带病毒的植物叶、茎、果实、根等粉碎后—20℃冰冻后制成匀浆→加5倍体积的0.1M,PH8.2的硼酸缓冲液(含2%PVP,2%尼古丁,0.01M EDTA和0.2%硫基乙醇)搅拌,双层纱布过滤→滤液在高速冷冻离心机6,000rpm,4℃离心20分→取上清液,加入6%PEG(MW6000),0.1M Nacl和1% Triton X-100,冰浴中搅拌至完全溶解,4℃过夜→高速机10,000rpm,4℃离心30分钟→取沉淀,悬浮于0.01M PH7.2的磷酸缓冲液(含0.001M EDTA和0.1% PVP)10,000rpm,4℃离心30分钟→取上清液,P40ST转头每管内铺5ml用以上悬浮液配置的20% w/w蔗糖(分析纯),上部铺上清液至距管口3mm,35,000rpm,4℃离心3小时→取沉淀,用以上悬浮物稀释后10,000rpm,4℃离心20分→取上清液,P40ST转头,10%~40%蔗糖梯度,每管样品约1ml,28,000rpm,4℃,3.5小时→从上部开始收集成30管,每管约400μl,分别测O.D.,绘成管数(横坐标)对O.D.(竖坐标)曲线,找到病毒峰所在离心管(取3-5管)→稀释后40,000rpm,4℃离心2小时→沉淀,悬浮即为纯病毒成份。
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