流式细胞术在血液学中的应用（六）

白细胞吞噬功能测定

粒、单核-巨噬细胞是机体免疫反应和免疫调节细胞中的重要成员。它们不仅具有吞噬功能,吞噬外来的微生物、肿瘤细胞等,同时又分泌多种生物因子参于免疫反应,此外单核-巨噬细胞对抗原物质的摄取、修饰、递呈等作用,是淋巴细胞的免疫功能必不可少的。因此检测白细胞吞噬功能对了解机体免疫状况有重要意义。以下简要介绍FCM测定白细胞吞噬功能的概况。

应用光学显微镜、荧光显微镜测定白细胞吞噬功能时须分离粒、单核细胞, 并尽可能地保持细胞活性。用FCM检测时不须分离细胞,应用全血即可, 因此可在自然状态下测定,结果准确可靠。

目标粒子一般以酵母、细菌等能激发自然吞噬作用或予先以抗体调理化的人造粒子为好;并标以荧光,常用者为FITC(异硫氰酸荧光素)或RA(罗达明).

以肝素或拘橼酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200μl全血与目标粒子200μl(目标粒子浓度4×107/ml)置37°C温育,温育结束后立即置冰水中, 以同样标本不在37°C温育而置于冰水中者作为对照。目标粒子不同温育时间不一,FITC标记的金黄色葡萄球菌25分钟,FITC标记的粒子15分钟即可达到吞噬饱和;此外,粒子与白细胞的比例也很重要,一般为10:1。温育结束后以溶血剂溶去红细胞即可上机检测。
 
应用FCM全血法测定白细胞吞噬功能,对白细胞的丢失、损伤最小;此外用本法可测定血清中的调理素(Opsonine)水平及血清中有无吞噬作用抑制因子。如果用FITC标记的单克隆抗体 CD13、CD14、CD15标记粒、单核细胞,用红荧光标记目标粒子,即可测定吞噬功能与细胞表面标记的关系,对白细胞吞噬功能作进一步的研究。

NK和LAK细胞活性测定

NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标。人NK细胞一般表达CD56、CD16、CD57部分表达CD2、CD8、CD11而不表达CD3。

LAK(Lymphokine Activated Killer cells)细胞主要存在于LGL的高密度群体中,LAK前体细胞表达NK细胞标志CD16而不表达T细胞标志如CD3、CD4、CD5等;它们不需要抗原刺激就能杀伤NK细胞不能杀伤的肿瘤细胞,并且无MHC限制性;从表型上看大多数LAK细胞来自NK细胞,但严格讲LAK细胞对K562细胞的杀伤活性不能称作LAK活性,测定LAK活性的靶细胞应为NK抵抗的实体瘤细胞,如HL-60细胞、HeLa细胞等。

常用的测定NK和LAK细胞活性的方法较多,如攩51Cr释放法、[3H]TdR参入法或释放法、LDH释放法、ATP发光法等;应用放射性同位素对人体和环境不利,利用FCM测定NK和LAK细胞活性从1986年就开始摸索,方法已趋于成熟,以下介绍其中一种:

肝素抗凝取外周血后分离PBMC后洗净,调整细胞浓度为106/ml,为效应细胞;靶细胞分别为K562和HL-60或HeLa细胞,在对数生长期受集细胞,调整浓度为106。用3mMDiO(3,3-Diacradecyloxacarbocyanine Perchlorate)标记靶细胞,效应细胞:靶细胞(E:T)为40:1、20:1、10:1和5:1,孵育后加入PI(10μg/ml)染死细胞,洗净后即可上机检测。DiO发绿荧光,PI发红荧光,利用双参数(FL1vFL2)直方图可清楚地了解靶细胞中的死亡细胞,计算出靶细胞%溶解率。

造血干/祖细胞测定

造血干/祖细胞移植已广泛应用于血液肿瘤、实体瘤、某些遗传性疾病、免疫缺陷病等，因此检测造血干/祖细胞已成为临床必不可少的手段。应用流式细胞仪多色技术测定外周血造血干/祖细胞，具有快速、准确的优点，不仅能确定造血细胞数量，而且能对造血干祖细胞的质量进行评价，为临床干细胞移植治疗提供重要数据。目前多色组合一般包括CD34、CD38、HLA-DR等McAb。

CD34抗原是一种分子量约11万的糖蛋白，选择性地表达于早期造血干/祖细胞、小血管内皮细胞和胚胎纤维母细胞表面。该抗原在原始造血细胞上表达，以后随细胞分化、成熟逐渐减少直至消失，因此一直作为造血干/祖细胞表面的一种特征性标志而广泛应用于造血干细胞基础研究和临床。CD34+细胞是一群不均一的群体，依其是否表达CD38、HLA-DR、CD33、c-kit等分出的亚群表现出了不同的造血性能。最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,有人经实验研究提出CD34的表达与造血干细胞的细胞动力学相关,细胞激活时CD34+,细胞处于稳定状态时CD34-;也有人提出CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早。我们认为：成人体内可能仍保留着一小部分原始间充质细胞，他们仍保留着多向分化能力，也能向造血干细胞分化，因此体内有CD34-造血干细胞和CD34+造血干细胞是正常的，CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早、更具造血潜能；但目前的用CD34+细胞代表造血干细胞的检查方法已足以满足临床需要，因为临床实践已证明这一点。理论研究往往能推动学术发展，开发新技术，我们期待着造血理论的不断发展给临床带来新技术，不断提高临床疗效。

我们用CD34、CD38、HLA-DR三色组合测定了151份外周血经动员后标本，CD34+细胞占单个核细胞（MNC）的（0.954±0.466）%，含量为（3.55±2.41）×109/L；其中CD34+CD38-亚群含量为（0.253±0.24）×109/L，占CD34+细胞的7.13%；CD34+HLA-DR-亚群含量为（0.273±0.310）×109/L，占CD34+细胞的7.61%；随着采集次数的增加，CD34+细胞及其亚群数量逐渐减少（P＜0.05）；随着供者年龄增加，其外周血CD34+细胞数逐渐减少，在≥40岁供者CD34+细胞百分比和含量比＜20岁供者分别降低了47%和50%；动员后外周血CD34+细胞数存在性别差异，男性供者外周血CD34+细胞数较女性高23%。 

应用流式细胞仪测定造血干细胞虽具有快速、准确的特点，目前被广泛采用。但应用中要特别重视质量控制，要建立一套完整质控方法以确保检测的准确性。