微卫星DNA分子标记及其应用（二）

3. 微卫星分子标记技术的应用

微卫星DNA 作为遗传标记具有很大的优越性。近年来随着研究的不断深入,对微卫星标记的研究不仅具有重要的理论意义, 而且还具有较好的应用前景。

3.1 微卫星多态性分析

在自然界中,生物个体表现出来的各种遗传变异,在本质上就是DNA 的差异,因此通过研究DNA的变异来分析群体的遗传结构及遗传多样性更为直接。微卫星其重复单位数量可能不完全相同,因而形成多态性,即SSR 分子标记,这可能是由于有丝分裂过程中同源微卫星间的不等交换或复制过程“链滑”(strand slippage) 作用造成的。微卫星多态性反映着物种的进化历史,共有的等位基因在该物种基因组中最为古老、保守。与蛋白质标记技术相比较,利用微卫星标记估计的群体遗传杂合度和遗传距离明显优于蛋白质多态性标记,而且在分析遗传关系较近的种群和品种时,微卫星标记比蛋白质标记具有更为准确的数值。

3.2 群体遗传多样性

Powell 等指出微卫星比其他分子标记如RFLP、RAPD、AFLP 更能揭示遗传多样性。Scott 等根据从5000个葡萄表达序列标签( ESTS) 中分离的124 个微卫星而设计的16 对SSR 引物,对7 个葡萄资源进行分析。结果证明: 在3’非翻译区(3’U TR) 分离的微卫星在品种间具有较高的多态性;在5’非翻译区(5’U TR) 分离的微卫星在种和品种间具有较高的多态性；而在编码区分离的微卫星在种和属间具有较高多态性。Fahima 等的实验证实,单子叶植物大麦及双子叶植物鹰嘴豆也存在串联排列( GTAT) n和简单重复序列( GACA) n ,而且显示出高度多态性。Plaschke 等用23 个SSR 标记对40 份欧洲小麦品种进行检测,共发现142 个SSR多态性位点,平均每个SSR 标记能检测到6.2 个多态性位点。郭小平等用137 对有扩增产物的引物对2 个玉米自交系B14 和B96 进行分析,发现有67 对引物显示多态性,反映了这2 个自交系在遗传物质上的差异。杨官品等用一个多拷贝微卫星DNA 标记分析了238 份栽培水稻的遗传多样性及遗传多样性从农家品种到现栽培品种的动态变化,共检测出16 种长度变异类型和32种表现型,表现了较高的多态性。Turuspekov Y等用微卫星引物分析了代表日本主要栽培地区的18 种大麦品种的遗传多样性,Shannon信息含量最高的是Kanto 地区,为0.524；而含量最低的是Tohoku 地区,为0.264。遗传距离从Tohoku 和Tozan 地区的0.105 到Shikoku 和Kyushu 地区的0.88 。通过聚类分析表明,同一地区栽培的品种大都归为一类,这反应了大麦在日本在栽培不但受历史亲缘关系的影响,同时也有地理和环境因素的影响。Tanya P 等用SSR 对5 个韩国大豆品种、8 个泰国大豆品种和3 个野生大豆进行了遗传多样性分析。

3.3 基因定位及构建遗传连锁图谱

由于微卫星重复单位数量多，重复单位片段短，且重复程度不一样，同一类微卫星可分布在整个基因组的不同位置上，可将随机PCR标记沿着染色体锚定在已知位置，因而可以用作功能基因定位。由于微卫星标记来源于基因本身的序列，因而通过对微卫星标记的定位，也就相应地定位了其来源基因。Beckmman和Soller 认为, 多态的签条微卫星( Sequence - tagged Microsatellite site ,STMS) 对基因定位提供了有效的标记。

遗传连锁图谱是利用遗传标记进行连锁分析来反应遗传标记之间的相对关系。现在使用最广泛的是微卫星标记。其基本原理是：以微卫星位点为基础，在基因组中每隔一定距离找一个多态性的微卫星标记，当这些标记达到足够的饱和度（约每隔10-20cm一个，并覆盖90%的基因组）后，则可借助微卫星标记找到基因组中的任何功能基因和QTL，并进行连锁分析，从而确定QTL在图谱的位置、与标记之间的遗传距离和QTL的表型效应。Akkaga等将121个微卫星标记整合到水稻四个群体的RFLP框架图上，平均每16-20cm就有一个微卫星标记。拟南芥、水稻、番茄、土豆和玉米在遗传图谱上1cm分别相当于物理距离的150kb、300kb、500kb、1000kb和1500kb。相信随着分子遗传标记技术尤其是微卫星技术的进一步完善,对于构建基因文库将会起到进一步的推动作用。

3.4 构建指纹图谱

基因组中各微卫星位点除重复数不同外，其碱基组成和结构是相似的，因此可以以微卫星的核心序列如（AC）n、（TG）n等作为多位点探针，在基因组中同时检测多个位点。由于不同个体、品种（系）或群体在被检测位点上存在一定的差异，通过电泳及杂交，这些差异将表现为杂交带的有无，即产生微卫星DNA指纹图。B.Beyerman等通过DNA指纹印迹技术，利用简单重复序列（GATA）₁和（GTG）₅作探针，证实了大麦和甜菜DNA指纹印迹区带的显著差异。

3.5 用于种质鉴定和品种分类

由于微卫星座位的复等位性，使它易于鉴别同一物种的不同基因型。Guilford等利用（GA）₁₅（GT）₁₅作为探针筛选苹果基因组文库，证明了这些重复序列的多态性，并且利用3个微卫星标记就能足以区分21个苹果品种。Akagi等利用高度多变的含（AT）n的17个微卫星标记，成功地区分了59个亲缘关系极近的粳稻品种。Aranzana MJ用SSR对100个桃品种进行分析，用7个多态性微卫星位点得到32个等位基因，可区分78个不同的基因型。

3.6 分子标记辅助选择

微卫星标记应用于标记辅助选择具有很大的潜力，它改变了从表型值推断基因型值的选择过程。分子标记辅助选择相对于传统的表型选择来说，可以获得更大的遗传进展，尤其对于低遗传力性状、限制性状和后期表达的性状，能增大选择强度，缩短世代间隔，提高选择的准确性。Zhang等利用微卫星标记来预测产量和估计杂种优势。

4. 展望

微卫星DNA的研究近年来已取得了明显进展,但微卫星DNA标记还存在很多问题，如微卫星DNA分子突变机制尚不完全清楚、PCR引物在不同物种间保守性较差、对于不同物种要进行特异性引物设计等，但微卫星DNA仍然是研究当前种内遗传变异中分辨率最高、揭示力最强的核DNA标记。相信随着微卫星DNA研究的不断深入，微卫星必将会在各个领域中有着更为广泛的应用。