试剂、试剂盒 Taq 聚合酶溶于水的 DNA引物
仪器、耗材 热循环仪
实验步骤
一、材料
1. 酶和酶缓冲液
Taq 聚合酶
许多 Taq 聚合酶都可以用;作者发现 Roche 公司的 Taq 聚合酶可以满足大多数需要. 如果需要提高PCR 产物的特异性,应该使用热启动聚合酶。使用 Tag 聚合酶本身附带的缓冲液。
2. 核酸和寡核苷酸
(1)溶于水的 DNA
如果 DNA 在 TE 中,应该在 PCR 反应混合物中添加 MgCl2. 如果用从石蜡包埋的组织中纯化的DNA 做模板,选择的 STR 标记的大小应该是 78~250bp, 因为这些 DNA 模板的完整性不定。
参照 DNA 可以从外周血组织或者非恶性组织中纯化获得。对于白血病,則难以获得肿瘤 DNA 的合适的参照 DNA。因此,使用从患病期间和痊愈之后的血液中提取的 DNA 作参照进行分析。
肿瘤 DNA。很难避免非恶性细胞对肿瘤组织的污染。对肿瘤组织进行显微解剖是避免污染的一种途径,但是该过程费时,而且产量低(参见第 11 章).
为了保证获得 LOH 分析的信患,应该分析大量的样品。因此,纯化过程必须是可靠的,可重复的,保证可以从大量的样品中提取出高质量的 DNA。—种评估肿瘤 DNA 质董的方法就是利用一部分样品,使用 STR 对已经确定的特异类型的肿瘤染色体上的 LOH 进行分析。
(2)引物
重要的一点就是细心地选择荧光基团以确保在所用的电泳仪器上能被检测到。例如,绿色的 TET 就不能在 ABI3100 仪器上使用。
标记的引物储备液可以保存在-20°C, 稀释之后的工作液可以在 4°C 保存. 放置黑盒中避光。
3. 专用设备
热循环仪
二、方法
1.在 0.2 ml 的离心管中,加入以下试剂。
DNA(溶于水) 10~20ng
引物(每一种)* 1pmol/L**
dNTP 溶液 250umol/L
Taq 聚合酶缓冲液 1X
Taq 聚合酶(Roche) 0.18U
H20 加到 6ul***
*每一标记组的毎一种引物分别被一种荧光基团标记.
**1.5~2.0pmol 的引物适合于许多反应。
***10ul 的终体积用于带有热盖的 PCR 仪上(样品上层不加矿物油)。
2.使用下面通用的 PCR 扩增程序进行 PCR 操作。
3.在琼脂糖凝胶上分析 3ul 的 PCR 产物。如果使用了新的引物,应用琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。在毛细管电泳之前,从 96 个样品中随机选择几个 PCR 产物进行分析。
4.如果在不同的退火温度下都没有得到 PCR 产物,那么在数据库中査看标记内部的CG 含置和特异的 CpG 岛。大董的 STR,特别是三核苷酸的 STR, 仅由 C 和 G 组成。当PCR 富含 GC 片段时,如第 5 章所述加入甜菜碱和 DMSO。
项目概况新疆维吾尔自治区农业科学研究院园艺作物研究所实验室仪器设备采购项目招标项目的潜在投标人应在政采云平台线上获取招标文件,并于2024年05月27日11:00(北京时间)前递交投标文件。一、项目基......
一、项目基本情况项目编号:GDYD240133项目名称:呼吸道多重(23重)病原体核酸检测试剂盒(荧光PCR法)采购方式:公开招标预算金额:1,904,400.00元采购需求:合同包1(呼吸道多重(2......
为便于供应商了解采购信息,根据《物资服务集中采购需求管理暂行办法》等有关规定,现将的采购意向公开如下:采购项目名称:业务相关仪器设备采购项目。序号需求概况预算金额(万元)预计采购时间1采购内容:气相色......
PCR检测——ISO标准发布近日,由上海海关主导制定的2项ISO标准正式获得国际标准化组织(ISO)通过并发布。这两项ISO标准是:《ISO/TS20224-10:2024分子生物标记分析——食品和饲......
近期,安图生物先后获国家药品监督管理局、河南省药品监督管理局颁发的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原检测试剂盒(磁微粒化学发光法)、抗线粒体M2抗体IgG检测试剂盒(磁微粒化学发光法)、人CYP2......
为便于供应商及时了解政府采购信息,根据《财政部关于开展政府采购意向公开工作的通知》(财库〔2020〕10号)等有关规定,现将山东省公共卫生临床中心(省胸科医院、济南市传染病医院)2024年02(至)1......
2月3日,新华社受权发布的《中共中央国务院关于学习运用“千村示范、万村整治”工程经验有力有效推进乡村全面振兴的意见》(简称《一号文件》),对生物育种产业化提出了新的要求和期待。文件明确提出,要推动生物......
全球动植物种质资源鉴定评价及确权交换中心项目-综合测试基地建设用地面积约200亩,其中规划可建设用地面积约21.6亩。包括新建一级测试圃六万余平方米,二级测试圃(二级隔离网室及温室)三万平方米,三级测......
山东大学荧光定量PCR仪采购招标项目的潜在投标人应在山东大学采购网(http://www.cgw.sdu.edu.cn/)获取招标文件,并于2023年12月22日14点30分(北京时间)前递交投标文件......
近日,忻州市市场监督管理局批准发布《PCR实验室医疗废弃物处置规程》。2023年10月13日发布,2023年12月13日开始实施。1、范围本文件规定了PCR实验室医疗废物处置的术语和定义、处置程序、技......