七、PCR检测
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。
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注意事项
1. 由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。样品间的相互污染可能产生假阳性结果，特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。
2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。
3. 不使用过量试剂“less is usually better (more specific)”。
4. 试剂购回后应分装成小份使用，这样一旦有污染发生，可以立即丢弃污染的试剂，不会造成大的损失；试剂分装也有助于减少反复冻融次数（例如dNTPs对反复冻融敏感）。
5. 加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以保证充分混匀。
6. 使用阴性对照检查污染的发生。
7. 使用阳性对照（能良好扩增的样本）。
8. 电泳时使用DNA分子量标准品（指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败）。
9. 当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二级结构的模板时适量使用添加剂（glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度；glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用；DMSO 减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性）。
10. 不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶（避免反复冻融），每次取酶时都使用新的枪头酶，酶使用后应立即放回冰箱。酶要在加完缓冲液后再加，直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。
11. PCR产物的电泳检测时间，一般为48 h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
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其他
一、 PCR反应的关键环节
1. 模板核酸的制备。
2. 引物的质量与特异性。
3. 酶的质量。
4. PCR循环条件。
二、 PCR常见问题及对策
1. 假阴性，不出现扩增条带
（1）模板原因
① 模板中含有杂蛋白质。
② 模板中含有Taq酶抑制剂。
③ 模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白。
④ 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤ 模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
（2）酶失活
① 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。
② 忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物
① 引物质量。
② 引物的浓度。
③ 两条引物的浓度是否对称。
解决对策：
① 选定一个好的引物合成单 位。
② 引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③ 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④ 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度
① 浓度过高降低PCR扩增的特异性。
② 浓度过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
（5）反应体积的改变
① 通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定;
② 在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
（6）物理原因
① 变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性。
② 退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
③ 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度有问题。
（7）靶序列变异
① 靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合。
② 靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列。
2. 假阳性，出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
（1）引物设计不合适
① 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性。
② 靶序列太短或引物太短。
（2）靶序列或扩增产物的交叉污染
① 整个基因组或大片段的交叉污染。
解决方案：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
② 空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。
解决方案：可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3. 出现非特异性扩增：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
（1） 引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体。
（2） Mg2+离子浓度过高。
（3） 退火温度过低。
（4） PCR循环次数 过多有关。
（5） 酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
4. 出现片状拖带或涂抹带
（1）原因
① 酶量过多。
② 酶的质量差。
③ dNTP浓度过高。
④ Mg2+浓度过高。
⑤ 退火温度过低。
⑥ 循环次数过多引起。
（2）对策
① 减少酶量。
② 调换另一来源的酶。
③ 减少dNTP的浓度。
④ 适当降低Mg2+浓度。
⑤ 增加模板量。
⑥ 减少循环次数。