实验材料 质粒
试剂、试剂盒 DNase 缓冲液EDTA 溶液TBE 缓冲液丁醇转化盐储液氨芐储液悬浮缓冲液硼酸缓冲液
仪器、耗材 水浴锅分光光度仪分光荧光计
实验步骤
本章主要介绍提高蛋白质热稳定性的常规方法，而不需要在高温下筛选酶活性。介绍完 β 内酰胺酶模型系统（见 16.3.1 )，我们描述末端截切（见 16.3.2 和 16.3.3 ) 的设计方案，它们对酶活的影响（见 16.3.4 )。突变库由酶的定向进化和错误向 PCR 产生（见 16.3.5)，然后在体内应用不同的筛选压力进行筛选（见 16.3.6)。在本节的最后一部分讨论截切突变体的再延长（见 16.3.7)、表达策略和纯化方案、酶学方法 ( 见 16.3.9 ) 以及稳定性检测（见 16.3.10)。
3.1 β-内酰胺酶模型系统
为了说明截切- 优化-再延长可以用来提高蛋白质的热稳定性，内酰胺酶被选作模型系统（图 16.1A )。作为一个临床发病机制相关的研究因子和重要的抗体，它所属的家族已被广泛研究，多个晶体结构已解析。许多对该酶的突变已被用于更好地研究和解释结构-功能相关性以及理性设计截切片段。此外，稳定的 β-内酰胺酶还被用于癌症治疗的潜在药物的活性研究，以便得到潜在的药物前体化合物 [ 27，28 ] 。
β-内酰胺酶的 A 家族（EC 3.5.2.6 ) 是细菌胞质酶，其氨基酸序列多样化，稳定性不同，但其三维结构很相似。尽管 β-内酰胺酶的 A 家族的肽主链在核心区能很好地重叠在一起，但在两个末端并没有很好的重叠性。末端结构的不同也与氨基酸长度和氨基酸组成相符合，让这类酶适合于研究序列同源和功能的相关重要性。
3.2 设计末端截切
缺失突变体的正确设计很重要：如果末端截切的过多，由于结构稳定性不够和错误折叠，其得到的截切突变体将没有功能；同样，如果截切的不够多，很有可能得不到期望的表型，选择压力将无法选择出稳定的结构。
如果目标蛋白的结构已被解析，可用 Protein Data Bank (PDB；http : //www.pdb.org/)，SWISSPROT ( http ： //www. expasy. org/sprot/和 http : //www.ebi. ac.uk/swissprot) 以及 SCOP ( http : //scop. mrc-lmb. cam . ac . uk/ scop/ ) 等数据库以及结构分析工具，如分子模型程序 WHATIF (http : //swift cmbi.
kuru nl/WIWWWI) 和 CE 运算法（http : //cl. sdsc . edu /ce . html) ，来进行结构比较和分析。另外，接触图可用作识别可能的非重要和重要的相互作用，这些在设计过程也很重要。如果没有高分辨结构，可用其他的数据 库（如 HSSP) 和 SWISS MODEL 同源模型服务器（http : //swissmodel. expasy. org) , 或者用一个或两个氨
基酸逐切来决定最大截切数。
在该研究中，根据以前的 β-内酰胺酶的突变体研究 [29] 而设计 4 个截切突变体，对 β-内酰胺酶的 A 家族进行结构同源序列比对，用 CE 运算法 [ 30 ] 和 SWIS& PDB 浏览器 [31] (http : //ww w. expasy. org/spdbv) ( 图 16.1B 和图 16.1C) 来分析结构。截切的突变体试图在生理温度下引入结构干扰而不会使蛋白质完全没有功能。N 端前 3 个氨基酸（ His、Pro 和 Glu) 有很高的温度因子（高达 23.8A，平均 13.1A )和溶剂可接触性（PDB 号1btl )，当去掉前 3 个氨基酸得到的突变体 N△3 对蛋白质稳定性的影响比较小。N△5 突变体去掉临近的苏氨酸和亮氨酸，其中苏氨酸被完全掩盖并与 C 端的 Ser285 氨基酸形成氢键。在 C 端，只有 1 个和 3 个氨基酸被去掉 （突变体 C△1 和 C△3 )，因为以前的研究表明末端酪氨酸是关键的氨基酸 [32] 。
3. 载体质粒的设计
载体质粒被设计为当野生型 β-内酰胺酶或截切的突变体与用于细胞间质定位的 N 端 pelB 信号序列融合表达。一 个短的天冬氨酸-甘氨酸的链接被引入用来确保 N 端不同的突变体同等的处理效率。最后，C 端连接 His-tag 可用于固定金属离子亲和柱来纯化，甚至能够纯化非野生型的 β-内酰胺酶变体（图 16.2A)。
载体构建步骤如下：
( 1 ) TEM-1β-内酰胺酶截切突变体 NA3、N△5 和 C△1 及 C△3 是由 pUC 衍生的 TEM-1 基因扩增而来，分别用其正向和反向引物。正向引物含 5' Sfi I 酶切位点，还包含 pelB 信号肽链的 C 端编码序列和 TEM-1 截切突变体的 N 端修饰（截切）序列。在基因的 3' 端，包含反向序列编码改造的 TEM-1 的 C 端序列、1 个短的序列（2 个甘氨酸残基）、5 个 His-tag、2 个终止密码子和 Hind lll 酶切位点。
( 2 ) 其 PCR 产物由 Sfi I/Hind III 双酶切、纯化，然后克隆到 pKMENGRbla (由 K.M.M. 提供）载体中，pKMENGRbla 是由表达载体 pKA400 [ 26 ] 改造而来，含有 1 个氯霉素抗性基因。
得到的质粒（pKJE_Bla—NA/CA 系列）在 lac 操纵子下表达了各种 TEM-1 突变体基因。尽管质粒上的 lacI 有组成型表达，强的 T7g10 Shine-Dalgarno 序列 [ 35 ] 有很高的表达水平，因此所有选择步骤在极端条件下进行，并未过表达。
3.4 末端截切对酶活性的影响
为了检测末端截切对酶活性的影响，在氨苄抗性递增的固体培养基和液体培养基中测其生长速度。通常，在固体板上的筛选比液体状态下更为苛刻。通过本底表达及 IPTG 诱导表达以及在不同温度下的诱导来观察体系的不同。
( 1 ) 如果有需要，用标准方法转化 BL21 细胞涂在 LB/Cm 板上。
( 2 ) 从甘油菌或者转化的过夜（16 h) 培养的 LB/Cm 板上 [ 步骤（1 ) ] 挑取单克隆。
( 3 ) 将过夜培养的菌，在新培养基中稀释至 OD600 为 0.1，并将其培养至 OD600 为 1 ( 见注 1)。
( 4 ) 将预培养的菌液 [ 步骤（3 ) ] 涂在含 IPTG 与不含 IPTG 的不同浓度的氨苄抗性板上。被涂的菌量可估量为 2.5X108 个细胞/ml，1 个 OD600。
( 5 ) 在液体 LB/Cm 培养基中加入步骤（3 ) 的菌液，在含 IPTG 与不含 IPTG 的不同浓度的氨苄培养基中培养。
( 6 ) 生长速率 [ 步骤（4 ) 和（5 ) ] 可以在不同温度下重复。
在不诱导情况下，于固体板上 37°C 培养，当氨苄抗性浓度从 0 μg/ml 增加到 50 μg/ml 时，所有截切突变体的克隆数急剧减少（图 16.2B) 。在连续培养 40 h 后突变体 N△5 和 C△3 没有长出克隆，说明了末端氨基酸的重要性。当 25°C 诱导时，N△5 能够在高达 50 μg/ml 的氨苄固体培养基中生长，在 37°C 液体培养基中在合适的供氧情况下仍能生长。这说明两个截切突变体都能干扰蛋白质结构，但同时可以折叠成有活性的结构。N△5 突变体比 C△3 对抗生素的容忍性更小，因此更适合于下一步的优化。
