将DNA导入酵母细胞实验

实验方法原理

实验材料 待转化的酵母菌株

试剂、试剂盒 YPD培养基YPAD培养基：添加30 mg L腺嘌呤半硫酸的YPD培养基高纯无菌水l0×TE缓冲液pH 7.5无菌10×乙酸锂储液：1 mol L乙酸锂pH 7.5 (用稀乙酸调pH)过滤除菌DNA ：高分子质量单链载体DNA和待转化DNA50% (m V) PEG 4000 或 PEG 3350 (不能用 PEG 8000)过滤除菌CM缺失成分培养基平板用Difco琼脂制备

仪器、耗材 恒温摇床、水浴锅

实验步骤

1)在开始实验前2天，接种待转化的酵母菌株的单菌落于5 mL YPD培养基中，于 30℃恒温摇床，培养过夜达到饱和。

2)转化的前一天晚上，往1 L无菌烧瓶中加入300 mL YPAD培养基，然后接种适量的 饱和培养液，再于30℃培养过夜，到细胞密度为1×l07细胞/mL OD600=0.3〜0.5，依据菌株而定）。为了获得2〜3倍高的转化效率，此时用新鲜的YPAD培养 液稀释使细胞密度为2×106细胞/mL，然后培养生长1〜2代（2〜4 h)。

因为生长期和细胞密度对获得最佳的转化效率是十分重要的，因此最简单的方式就是在3个不同 的烧瓶中分别接种不同体积的饱和培养液，例如，在12 h的生长期可尝试加入1μL、5μL和25μL过夜培养液，然后在第2天检查每个烧瓶中培养液的OD600值。

3)培养液在室温条件下4000 g离心5 min，收集细胞。细胞用10 mL无菌超纯水重悬，然后转移到一个更小一些的离心管中，再于室温下5000〜6000 g离心5 min,沉淀细胞。

4)细胞用1.5 mL锂盐溶液重悬，锂盐溶液按下列方法配制，现配现用：

1体积10×TE缓冲液，pH 7. 5

1体积10×乙酸锂储液 8体积无菌超纯水

5)每次转化时，200 载体DNA和<5 转化DNA —起加入1. 5 mL微量离心管中混匀，DNA的总体积<20μL。

要获得最佳的转化效率，转化之前要重复对载体DNA进行变性循环处理（沸水浴和冰浴）。

6)往每个离心管加入200μL用锂盐溶液重悬的细胞悬液，再加入1. 2 mL新鲜配制的PEG溶液。PEG溶液配方为：

8 体积 50% PEG

1体积10×TE缓冲液，pH 7.5

1体积10×乙酸锂储液 30℃摇荡温育30 min。

7)于42℃热激15 min,室温下离心5 s,细胞沉淀用200μL 〜1 mL 1×TE缓冲液（从 10×储液新鲜配制）重悬，并取其中200μL涂布在Difco琼脂制备的CM缺失成分培养平板上。30℃培养2〜5天，直到出现转化子。

注意事项

注意：所有溶液和与酵母细胞接触的玻璃器皿必须是无菌的。在玻璃器皿上任何痕量的去污剂都 可降低转化的效率。另外，用于配液和清洗玻璃器皿的水必须具有很高的纯度。

其他

最常用的酵母菌转化方案，不仅快捷，而且转化效率高。