实验方法原理
神经元在发育过程中早于胶质细胞,因此通常选择胎鼠做脑内神经元培养。一般取El7-l8d孕大鼠或El4-16d孕小鼠做神经元培养。新生1d的仔鼠也可以用来培养神经元,但培养成功后杂细胞较多,有时需要进一步纯化。这两个部位的细胞培养方法类似
实验材料 El7-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠新生Id的仔鼠
试剂、试剂盒 含10%胎牛血清的DMEM培养基神经元维持培养基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺)
仪器、耗材 培养瓶
实验步骤
1.根据离心前细胞计数的结果,先用少量神经元维持培养基重悬细胞,充分重悬后,补加液体至合适体积,按照(2-4)x104/cm2的密度在培养板、玻片等介质上接种细胞,并置于37℃孵箱培养。
2.培养过程中接触细胞要注意动作轻柔,接种Id后应避免把细胞从孵箱中拿出,可根据培养液的颜色和亮度观察污染情况(污染的细胞,培养液混浊、发黄;正常应该是清亮透明的)。3d后1/3量换液,并可利用神经元标志物的免疫化学染色鉴定纯度。第5天起每隔2d 1/2量换液,并可以根据神经元的成熟程度用于实验。
3.如果觉得神经元纯度达不到实验的要求,可以添加阿糖胞苷(终浓度为5µM),作用2d后,1/2量换液,逐渐去除。
培养成功的神经元,无污染,相差显微镜下细胞折光性好,细胞碎片很少或没有,突起长,培养基清亮,细胞有一定的间距,没有成团存在,分布均匀,而且没有太多的杂细胞。培养不太好的细胞,杂细胞多,神经元状态一般或很差,细胞碎片较多
注意事项
1.神经元培养时常为1/2量换液,在换液前应将培养液在37℃水浴锅中充分复温,冷刺激和全量换液刺激都会使细胞活力下降。
2.鼠龄越大,其神经元的培养,操作越要轻柔精细,关键在于消化过程和吹打过程。消化时间、吹打次数对细胞活力的影响在原代培养中是最大的。在保证可以获得足够单细胞悬液的前提下,应适当缩短操作时间和步骤。
3.海马和皮层神经元的培养没有大的区别,皮层细胞丰富,很容易收集细胞,但是杂细胞较多。
4.利用孕鼠做神经元的培养,纯度高于新生鼠,而且活力更好。培养海马神经元时,孕期不足,海马尚未完全形成,较难分离,但是取皮层就没关系了。
其他
实验心得:
1.应用阿糖胞甘作用于神经元,细胞纯度会高一些。1/2量换液去除时,虽然会存在残留,但是这样的浓度对神经元活性的作用基本可以忽略。
2.在包被玻片时,习惯将8片玻片置于已加入2ml PLL的小皿中,一片一片的加,加完后用弯管小心吹匀,盖上皿盖后,轻轻震摇。再放入孵箱包被过夜。包被结束后,以无菌水漂洗2遍,并以弯摄一片一片的夹出来,置于已灭菌的纱布上,超净台内吹干。
3.接种细胞爬片时,先以(2-4)X105/100µL的浓度配好单细胞悬液,在玻片上接种100µL,静置20min后,移至培养箱培养,2-3h后补液至400µL。这种方法接种的细胞能够均匀分布于爬片上。
4.为了避免长时间培养出现培养液变干的情况,可以在培养板每孔之间的间隙加无菌水。
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