神经细胞原代培养

实验方法原理

神经细胞的原代培养是尽 量 创造最适合于各类神经细胞生长的体外环境，获得状态良好，纯度较高细胞的方法 。 由于脑部组织来源的各种神经细胞的培养具有相似的取材过程和部分通用的培养条件。

实验材料 动物组织

试剂、试剂盒 消化液(0.25%胰蛋白酶+O.04%的EDTA)完全培养基(DMEM+10%胎牛血清＋双抗）D-PBS液多聚赖氨酸（包被浓度1OOµg ml)灭菌超纯水殡伏75%酒精

仪器、耗材 体视显微镜相差显微镜精细器械（弯镊、直镊、虹膜剪、75%酒精消毒）眼科器械（弯镊、直镊、剪刀共3套高压消毒）各种规格细胞培养瓶和皿（均来自Nunc公司）弯头滴管1ml刻度滴管15ml离心管100mm玻璃皿200目细胞筛网低温冰袋

实验步骤

除动物消毒以外，其他步骤都在超净台内进行 。

1. 动物的消毒：根据培养细胞的类型和要求不同，常用胎鼠和新生鼠做神经细胞的培养 。 消毒方法分别如下 。

(1) 孕鼠操作 孕鼠经戊巴比妥钠麻醉后，以棉球蘸碘伏擦拭腹部毛皮消毒 。 擦拭从中心向外方向进行，可更换棉球 1- 2次，面积尽量大一些，包括整个腹部和外生殖器周围 。 用第 1 套解剖器械打开动物腹腔，换第 2 套器械分离子宫并置于含冷 D ­PBS 的 100mm 玻璃皿中，再换第 3 套器械在每只胎鼠的间隔处剪开子宫并剥离出胎鼠 。

(2) 仔鼠操作 仔鼠（新生 7d 以内）直接浸泡于冰的 75%酒精中， -20℃冰箱低温消毒 10min 左右，动物失去知觉即可开始取材 。

2. 皮层组织的分离：新生鼠使用眼科剪将动物断头，并用镊子剥除头部的皮肤 。在冰 D -PBS 液中沿颅骨人字缝从后向前剥离 。 一般左手持弯镊，在动物两眼处以适当力度固定；右手持直镊，完成剥除皮肤 、 骨骼以及分离组织等工作 。 在显微镜下利用精细器械分离皮层或海马时，沿皮层边缘以 45° 角小心划开，并逐步使之剥离，转移组织入盛有冰 D - PBS 液的 35mm 小皿中；然后用精细器械仔细去除每个皮层或海马的脑膜（整个过程需要在低温冰袋上完成） 。

3.组织的分散；用管口较粗的弯头滴管吸去带有脑膜的 D - PBS, 尽最去除干净液体并避免吸走组织；用虹膜剪将组织逐撮均匀剪成乳糜状，使组织块为 lmm3 的大小为宜 。 加入合适体积的消化液（－般盖过组织块并且可以随意摇晃即可），并均匀分散组织，放入37°C 孵育箱中消化约 15min (每间隔 3 -5min 用手轻轻摇晃1次，动物胎龄越小，越容易分散，消化时间可相应缩短） 。

4. 单细胞悬液的制备!用口径较粗的弯头滴管将消化好的组织吸入含 3 - 5ml 冰的完全培养基的 10ml 离心管中，静置 5min 左右 。 用同样的滴管将沉底的组织转移到另 一个含约 5ml 冰的完全培养基的 10ml 离心管中，并开始吹打 。 吹打时每次不超过 15 次，先用粗口径的弯头滴管吹散，静置片刻后将上清用细口径弯头滴管转移至另 一个离心管中，并再吹打 15 次左右 。 在原先含沉淀的离心管中再加入完全培养基继续吹打，并收集上清重复上述过程 。 反复吹打几次后，组织块基本消失，将全部上清过 200 目筛网以去除剩余组织块并收集、计数 。 离心 (900r/min, 5min) 去除细胞碎片并将细胞重悬至合适的体积，以备后用 。

注意事项

1.在做原代之前准备工作一定要做好，提前配好液体。整个操作过程注意无菌，且培养液中如无特殊说明，均含有青－链霉素（双抗）。

2.动物消毒应在远离超净工作台的区域完成，成年动物尤其要注意。

3.组织取材过程全部在低温环境中进行，可大大提高细胞存活；而且整个过程不宜太久，否则细胞活性明显降低。

4.在组织分散过程中，一般3只左右动物来源的皮层在一个小皿中剪碎消化，不宜在同一个小皿中处理过多的组织。

5.吹打细胞用的弯头滴管一定要事先经火焰抛光，否则细胞极易受伤而死亡；而且吹打细胞悬液时尽量避免产生过多气泡，可以提高细胞的存活。

6.基本上原代培养的各种神经细胞都需要生长在经特殊物质处理过的培养介质上，比如多聚赖氨酸、层黏连蛋白等

其他

实验心得：

1.大鼠和小鼠来源的神经细胞培养方法大致上相同，除特殊提到以外，基本可以通用。2.去除脑膜时，一般左手持慑轻柔固定组织，右手负责剥离。整块脑膜一同被剥离后，往往细胞培养物中的成纤维细胞污染较少。

3.胰酶消化液处理后的组织往往发黏，这是细胞释放出DNA的原因。这并不会影响消化效果，而且可以在后面的吹打过程中去除。对于初学者，可以通过在消化液中加入DNA酶的方法提高最终细胞的产量。

4.在胰酶消化液中加入EDTA有利于组织细胞团分散成单细胞，终止EDTA的作用主要依靠稀释以降低其浓度。