淋巴细胞信号转导研究中常用方法

  信号转导是目前分子免疫学中研究的热点。免疫学中所涉及的信号转导主要包括淋巴细胞的信号转导以及细胞因子/细胞因子受体的信号转导，其研究手段多种多样，包括细胞生物学、分子生物学以及蛋白质化学等技术。本节将扼要介绍目前信号转导研究中常用的方法和技术。

　　一、磷酸化的信号转导分子的鉴定

　　在淋巴细胞信号转地过程中可发生多种蛋白底物的磷酸化，包括酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化。它们分别由不同的蛋白激酶所催化。这些磷酸化蛋白通常都为信号转导分子，在信号传递过程中发挥重要的作用。一些信号蛋白结构中含SH-2结构域可同某些磷酸化的酪氨酸残基相结合，使信号得以逐级传递。含酪氨酸磷酸化的蛋白鉴定通常是首先分离粗提蛋白，采用针对含这些氨基酸残基磷酸化蛋白的单克隆抗体进行免疫沉淀　（immunoprecipitation)，SDS-PAGE电泳，然而采用Western blotting及immunoblotting鉴定其分子量，进一步利用分子生物学技术克隆信号蛋白，搞清其基因结构和氨基酸序列。

　　二、信号转导中第二信使含量的测定

　　信号转导过程中，第二信使（second messenger)含量的高低同信号传递密切相关。目前测定的第二信使主要包括细胞内Ca2+（[Ca2+]i)、二酰基甘油（DAG)、三磷酸肌醇（IP3)以及环腺苷酸（cAMP)等。

　　1.[Ca2+]i的测定　细胞内Ca2+的测定方法有原子吸收光谱法、离子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。目前常用标记示踪法，即用荧光探针标记靶细胞。常用的荧光探针有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等。Fura-2/Am和Indo-1较为敏感。

　　2.IP3的测定　采用3H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后，用不同的刺激剂刺激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离子交换层析柱（Serva公司Dowex1*8)分离洗脱，收集IP3洗脱峰后进行液闪测定。此外，还可以使用Amersham公司生产的D-myo-IP3[3H]分析系统直接测定粗提物中的IP3含量，此方法简易、敏感。

　　3.DAG的测定　首先提取含DAG的样品，然后采用Amersham公司生产的DAG分析系统进行测定。此系统测定的原理是用DAG激酶催化底物DAG，使之发生磷酸化，外源加入32γ-ATP，最后将反应产物进行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含量。

　　4.cAMP的测定　可选择不同的方法：（1)cAMP[3H]分析系统，其优点是放射性半衰期长，可用于大量样品的分析；（2)cAMP[125I]分析系统，用于小量样品的分析；（3)cAMp ILISA测定方法，此方法简便、敏感。

　　三、激酶活性的测定

　　信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化，因而对这些激酶活性的测定可以作为信号转导研究中的一种重要指标。常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。检测原理是根据激酶可以催化特定底物发生磷酸化，外源加入32γ-ATP，通过分离反应产物后测定放射活性，从标准曲线推算出样品酶的活性。前已提及，PKC从胞质向胞膜的转位是PKC活化的一个重要指标，因而分离胞质和胞膜中的PKC并分别测定其活性，计算胞膜上PKC活性占总PKC活性的比例，从而判定PKC的活化程度。

　　四、细胞核转录因子的分离和鉴定

　　信号转导的结果是细胞核内一些转录因子同DNA上某些特定的序列结合，调节转录活性和基因的表达水平。因而分离鉴定细胞内核转录因子在信号转导研究中具有独特的意义。根据核转录因子可与一些特定的核甘酸序列结合的特点，将其特定的核苷序列标记上同位素，来鉴定信号转导中的核转录因子。核转录因子具有一些特征性的结构域，即亮氨酸拉链（lucine zipper)、锌指结构（zinc finger)和螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix)结构。并且受用足迹法（foot printing)分析新发现核转录因子结合DNA的位置和核甘酸序列。

　　随着分子生物学核技术的发展，信号转导研究取得很大进展。采用基因克隆技术发现了越来越多的信号蛋白分子；嵌合分子的构建及基因转染等技术的应用为细胞因子的信号转导研究提供了有效的手段；点突变、肽竞争等技术使信号蛋白中某些功能区的作用的研究变得更为精确。