（2）反应增强剂：PCR反应中加入一定浓度的增强剂如1%～10%二甲基亚砜（DMSO）、5%～20%甘油、非离子去污剂、1.25%～10%甲酰胺和10～100 μg/ml牛血清白蛋白等可提高反应特异性和产量，有些反应只能在这些辅助剂存在时才能进行。
（3）热启动PCR：如果PCR反应混合物置于低于Tm值温度时，会在极短时间内产生引物二聚体和非特异性配对，而热启动PCR方法则可大大减少这种情况的发生。具体方法是：先将PCR反应体系升温至95℃，预变性2～5
min后，将仪器设在暂停，在这一高温条件下迅速加入耐热DNA聚合酶后再恢复循环。热启动可以防止模板变性不充分，同时还避免了耐热DNA聚合酶活性的迅速下降。
四、PCR技术的主要用途
1.
目的基因的克隆 PCR技术为在重组DNA过程中获得的目的基因片段提供了简便快速的扩增方法。该技术可用于：①与逆转录反应相结合，可以直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段；②利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段；③利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中提取具有一定序列相似性的基因片段；④利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。
2. 基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。
3.
DNA和RNA微量分析 PCR技术高度敏感，对模板DNA的含量要求很低，是DNA和RNA（RNA一般需要先逆转录成为cDNA）微量分析的好方法。从理论上讲，只要存在1分子模板，就可以获得目的片段。在实际工作中，一滴血、一根毛发或一个细胞就足以满足PCR的检测需要。因此，PCR在基因诊断方面具有极广阔的应用价值。
4. DNA序列测定 将PCR技术引入DNA序列测定，可使测序工作大为简化，也提高了测序的速度。待测DNA片段既可以克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。
5. 基因突变分析 基因突变可引起许多遗传病、免疫性疾病和肿瘤等，故分析基因突变可以为这些疾病的诊断、治疗和研究提供重要的依据。利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。
五、几种重要的衍生PCR技术
PCR技术的发展以及和已有分子生物学技术的结合形成了多种PCR衍生技术，大大提高了PCR反应的特异性和应用的广泛性。现仅举几例介绍与医学研究密切相关的PCR衍生技术。
1. 逆转录PCR技术 逆转录PCR（reverse transcription PCR,
RT-PCR）是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。即首先以RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，然后再以cDNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因。RT-PCR是目前从各种组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性和/或定量分析的最有效方法之一，具有敏感度高、特异性强和省时等优点。
2. 原位PCR技术 原位PCR（in situ PCR,
ISP）是在福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种好方法。
3. 实时PCR技术 实时PCR（real time PCR）技术是近年发展起来的一种新的核酸微量分析技术，尤其是在定量RT-PCR中具有重要的价值。
实时PCR的基本原理是引入了荧光标记分子，使在PCR反应中产生的荧光信号与PCR产物的量成正比，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，便可计算出PCR产物的量。根据动态变化数据，可以精确计算出样品中原有模板的含量。基本原理如图14-2所示。与传统PCR反应相比，在常规的正向和反向PCR引物之间增加了一对特殊的引物作为探针，探针的5'端有一个荧光报告分子（reporter,
R），3'端有一个荧光淬灭分子（quencher,
Q）。没有扩增反应时，探针保持完整，荧光报告分子和荧光淬灭分子同时存在于探针上，于是荧光信号被淬灭，无荧光信号释放。随着PCR的进行，Taq
DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合着的荧光探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将该探针逐步切断，报告荧光基团一旦与淬灭基团分离，便产生荧光信号。后者被荧光监测系统接收，用于数据分析。实时PCR技术实现了PCR反应从定性到定量的飞跃，目前已逐步得到广泛的应用。