单胞菌（monad）的人工感染与分离（3）

本实验采用注射的方法。实验鱼在实验前需进行 1 ～ 2 周的暂养。每组实验用鲫鱼 10 尾，每尾肌肉或腹腔接种 0 . 1 ～ 0 . 5ml 稀释后的肉汤培养物，置盛有水的水族箱内，用控温仪使温度维持在 28 ～ 30 ℃ 左右。定时投饵和换水，同时设接种无菌生理盐水的对照组。
4 ．观察记录
观察接毒鲫鱼的发病症状及死亡情况，并做好记录。
5 ．细菌分离
对濒临死亡或刚死不久的鲫鱼进行病原菌的分离。
鱼体表： 取病灶部分小片或用接种环刮取病灶部位，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板（鲜血）上划线分离。
内部组织器官： 用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，用剪刀在火焰上烧灼灭菌，再在组织上烫之，杀死表面的杂菌，随即在烧灼部刺一小孔。用灭菌的接种环（待冷 2 ～ 5 秒），伸向烧灼部小洞中，用手指将接种环轻轻旋转两次，借以达到取足材料的目的。左手持握普通（鲜血）琼脂平板（平皿盖留在桌上），使之尽量垂直，以免空气中杂菌落入，并靠近火焰，右手持带有细菌材料的接种环在穷汉字平板上分区划线。划线时接种环面与平板表面成 30 ～ 40 度的角轻轻接触，在平板表面轻快地移动，接种环不应嵌入培养基内，且不要重复，否则形成菌苔。划线完毕，盖上皿盖，接种环灭菌后放下，并在平皿底部用记号笔注明接种材料、日期及操作者代号。也可对实质性脏器用无菌剪刀下一小块，用镊子夹住病科使其剖面接触洁净的玻片，作多个触片，染色后在显微镜下直接镜检，能快速获得结果。
鳃部： 用无菌接种环刮取鳃上的分泌物划平板。
血液及体液： 用无菌注射器吸取病鱼血液和体液，滴于平板涂布或划线及肉汤内，分离细菌。
四、实验操作步骤
（一）致病菌的培养和实验前的准备工作
1 ．实验鱼的驯养
1 ）实验材料：养鱼的塑料箱，异育银鲫，控温加温棒，充气泵，气管，气头，温度表
2 ）实验方法：实验用的健康异育银鲫，在加网罩的塑料箱中驯养约一个星期，充气增氧，在驯养期间水温逐渐升高，每天温度升高 2 ～ 4℃ ，最终保持在 28 ～ 30℃ 左右。及时吸污和换水，保持水质清新。
2 ．致病菌（嗜水气单胞菌）的扩大培养
1 ）实验材料：营养琼脂培养基斜面（每组 2 支），接种环（ 1 支），嗜水气单胞菌斜面菌种（ 1 支）。
2 ）实验方法：按微生物学实验方法把菌种接种到营养琼脂培养基斜面上，放在 28℃ 培养箱中培养 24h 小时候备用。
3 ．营养琼脂培养基平板
1 ）实验材料：灭菌空培养皿（每组 4 只）， 250ml 三角烧瓶（每组 2 只）， 100ml 量筒（ 1 只），天平（ 1 台），营养琼脂培养基，称量纸，搅拌玻璃棒。
2 ）实验方法：称取 4.1 克 营养琼脂培养基，倒入三角烧瓶中，加入用量筒量取的 100ml 蒸馏水，用玻璃棒搅拌稀释后，用棉塞塞住三角烧瓶，待灭菌，灭菌后温度下降至 40 ～ 50℃ 时倒平板。
4 ．致病菌感染和分离时所用器械灭菌
1 ）实验材料：剪刀（每组 3 把），镊子（每组 3 把），注射器（每组 3 只），针头（每组 5 只），滴管（每组 3 个），铝盒（每组 1 个）。
2 ）实验方法：洗净所有的器械装入铝盒中灭菌，备用。
（二）致病菌的人工感染
1) 实验材料：嗜水气单胞菌斜面（每组 2 支），试管架（ 1 个）酒精棉球（ 1 瓶），无菌生理盐水，灭菌空试管，麦氏比浊管。
2 ）实验方法：用装有针头的注射器（或无菌吸管），吸取无菌生理盐水，滴注到培养有嗜水气单胞菌的斜面上，振荡使斜面上的菌落洗下（或用灭菌接种环轻轻刮下），倒入灭菌空试管中，用无菌生理盐水稀释调节菌浓度，与麦氏比浊管进行比色，使菌浓度达到 2.1×10 9 个细菌 /ml （ 21 亿），用灭菌注射器抽取菌悬液，待人工感染时用。注射部位在鱼的背鳍前端与侧线之间的中部区域。用酒精棉球在注射部位擦拭进行体表消毒后进行肌肉注射。针尖斜向鱼的头部，与鱼体成 30° 左右的角度插入肌肉，注射深度在 1 ～ 1.5 cm 。每尾鱼注射量为 0.6 ml ，每天观察鱼的发病及症状等情况并做好记录。
（三）致病菌分离
1 ．实验材料：灭菌的剪刀（每组 3 把），镊子（每组 3 把），解剖刀，接种环，营养琼脂培养基平板（ 4 只）。
2 ．实验方法：将具有症状的活鱼或刚死的鱼，放在瓷盘中，用拧干的酒精棉球在病鱼体表进行消毒，用剪刀从靠近肛门的地方向上剪开再沿侧线向前剪开，至鳃腔后缘，向下剪至胸鳍基部。用无菌镊子揭开腹壁，暴露腹腔。解剖刀上的刀片在火焰上烧灼后，迅速压印在鱼的肝（或肾）表面灭菌，再用烧灼后的接种环在肝（或肾）地灭菌处插入脏器内，旋转 1 ～ 2 圈后抽出，在营养琼脂平板上进行划线分离，作好标记（时间、脏器名称），放在 28℃ 培养箱中培养 24 h 后观察菌落形态特征，在占比例高的菌落形态一致的菌落中挑选一个菌落，用接种环挑起接种到斜面，作为致病菌株的候选对象。（分离出的菌株再进行人工感染，观察是否发病及病症是否与该病病鱼症状一致，如一致，分离的该菌株为致病菌，再次人工感染实验省略）。