病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备（3）

（二）疫苗制备
1 ．病原菌的扩大培养与分离
液体培养：按配方配制 2216E 液体培养基，将培养基用 三角烧瓶分装并盖上棉塞后置 于高压蒸汽锅内， 121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，冷却后于超净工作台内加入 1ml 左右预先制备的病原菌菌液，盖上棉塞，用摇床于 28~ 30 ℃ 下震荡（约 150rpm ）培养 24~48h 。病原菌经扩大培养后以 3000~5000rpm 离心 20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸缓冲液）配制成 1% 或 1 ‰左右 的菌悬液。
茄子瓶扩大培养：按配方配制 2216E 琼脂培养基，于高压蒸汽锅内， 121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热倒入经干热消毒的茄子瓶内（每瓶约 15ml 培养基），茄子瓶用消毒棉塞封口后平放于超净工作台台面，稍予摇动使培养基平铺于瓶壁，冷却后制成茄子瓶平板。用无菌滴管吸取预先制备的病原菌菌液，在每个茄子瓶平板表面滴加 3~4 滴，再用经灼烧消毒并冷却的玻璃涂布器将菌液涂布均匀， 28~ 30 ℃ 下培养 24~48h 。用无菌 PBS 洗脱平板表面的菌苔，洗脱液经 3000~5000rpm 离心 20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸缓冲液）配制成约 1% 或 1 ‰ 的菌悬液。
2 ．灭活
化学灭活：以福尔马林作为化学灭活剂。灭活前先确定福尔马林对该病原菌的安全灭活浓度，确定方法为：取 7 支灭菌试管，分别 5ml 加入预先制备病原菌菌液，其中 6 支装有菌液的试管分别依次加入一定量的福尔马林，使福尔马林的终浓度分别为 0.1% 、 0.2% 、 0.4% 、 0.6% 、 0.8% 、 1.0% ，另 1 支试管不加入福尔马林作为对照；于 4 ℃ 下放置 24h 后，于每支试管中分别取 0.2ml 菌液于 2216E 琼脂平板上涂布， 28~ 30 ℃ 下培养 48h ，检测各试管内细菌的存活情况，只有没有细菌生长的对应福尔马林浓度才是该病原菌的灭活安全浓度。向第 1 步中制备的 1% 菌悬液内添加福尔马林，使福尔马林的最终浓度达到安全灭活浓度以上， 于 4 ℃ 下放置 24h ，制备灭活菌液。
其他灭活方法：除化学灭活，疫苗制备时还可采用热灭活、紫外线和超声波灭活等方法。
3 ．安全性检测
活性检测：取 0.2ml 灭活菌于 2216E 琼脂平板上涂布， 28~ 30 ℃ 下培养 48h ，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在。
安全检测：将所制备的灭活菌液稀释成疫苗接种所用的浓度（一般为 10 8 cfu ），用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，经 20d 观察无发病或死亡才说明该灭活细菌是安全的。
4 ．效果检测
抗体效价检测：用注射法将稀释后的灭活菌液接种到 无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，连续养殖 2 个月，从第 10d 开始每隔 10d 取 3 尾以上接种生物用 微量血凝板法检测其平均凝集抗体效价 。抗体效价检测方法为：抽取感染动物血液并离心分离血清，用取样器吸取 0.1ml 血清加入经灭菌的 96 孔板的 A1 孔内，在 96 孔板 A 行的其他孔内加入 0.05ml 无菌 PBS ，从 A1 孔内取 0.05ml 血清加入 A2 孔内，混匀后再从 A2 孔内取 0.05ml 液体加入 A3 孔内 …… ，如此重复，使 96 孔板内后 1 个孔内的血清浓度均比前 1 个孔低 1 倍（倍释法），再在 96 孔板的每个孔内加入 0.05ml 菌液（活的或灭活的均可）， 37 ℃ 孵育过夜后观察（最好在 96 孔板下垫一张黑纸以增加反差），出现沉淀的最高血清稀释倍数即为血清中所含抗病原菌抗体的效价。比较不同时期内抗体效价的变化情况，确定最高抗体效价值。一般情况下，抗体效价越高，灭活细菌作为疫苗的效果就最好。
攻毒感染实验：选择 无患病史的同种同龄寄主动物（水产养殖动物）作为感染对象，用注射法进行攻毒感染。 用注射法将稀释后的灭活菌液接种到 无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，连续养殖 2 个月，从第 20d 开始每隔 20d 取 10 尾以上接种生物用 活的病原菌进行感染，感染方法为： 。
（二）致病菌的人工感染
1) 实验材料：嗜水气单胞菌斜面（每组 2 支），试管架（ 1 个）酒精棉球（ 1 瓶），无菌生理盐水，灭菌空试管，麦氏比浊管。
2 ）实验方法：用装有针头的注射器（或无菌吸管），吸取无菌生理盐水，滴注到培养有嗜水气单胞菌的斜面上，振荡使斜面上的菌落洗下（或用灭菌接种环轻轻刮下），倒入灭菌空试管中，用无菌生理盐水稀释调节菌浓度，与麦氏比浊管进行比色，使菌浓度达到 2.1×10 9 个细菌 /ml （ 21 亿），用灭菌注射器抽取菌悬液，待人工感染时用。注射部位在鱼的背鳍前端与侧线之间的中部区域。用酒精棉球在注射部位擦拭进行体表消毒后进行肌肉注射。针尖斜向鱼的头部，与鱼体成 30° 左右的角度插入肌肉，注射深度在 1 ～ 1.5 cm 。每尾鱼注射量为 0.6 ml ，每天观察鱼的发病及症状等情况并做好记录。