限制性内切酶（restrictionenzyme）酶谱分析

一、实验目的

在DNA上以限制性内切酶的酶切位点作为标记所绘制的物理图谱就是限制性内切酶图谱，限制性内切酶图谱与其他相关资料联合使用，可用于基因克隆、分离和基因功能研究。

二、实验原理

（一）酶切图谱的构建

限制性内切酶在DNA上有特异的识别和切割位点，可将DNA切开而得到两个或两个以上的大小不同的片段，这些片段可通过电泳分离并检测其大小。双酶切法酶切图谱构建是使用两种不同的限制性内切酶对同一个DNA分子进行单酶切和双酶切，将所得的片段进行对比组装，对交替区域进行加减以确定酶切位点的相对位置。

假如n代表某限制性内切酶在DNA上的酶切位点数，F代表完全酶切后的片段数，则线形DNA单酶切后:F=n+1,而环状DNA单酶切的F=n。若使用双酶切时，所得的片段中有两类：一是与单酶切片段完全相同的保留片段：二是单酶切片段备再切割后小片段，这些的片段的分子量之和等于单酶切片段的分子量。将以上片段电泳后，遵循以下“三三”规则进行分析：

1、区分三类片段，并做好标记：

（1）消失片段Fd(Disppeared fragment)，即单酶切片段经双酶切后消失的片段。

（2）保留片段Fr(Remaiined fragment)，即单酶切片段经双酶切后仍保留的片段。

（3）接头片段Fl(Linker fragment)：即双酶切后出现的新片段，由Fd再切割而来。

2、分析三类片段的关系：

（1）两种酶的Fd总数相同，而Fr总数不等。

（2）Fd的片段总数为的1/2。

（3）两种酶Fl的相同。

3、排列三类片段，构建酶切图谱：

（1）首尾排列：每种酶Fd的片段的首尾只能接Fl片段。

（2）夹心排列：一种酶的Fr片段只夹于另一种酶的两个Fl片段中间。

（3）镶嵌排列：两种酶的Fd段彼此镶嵌排列，由共同的Fl片段连接。

此外，应注意：

① 若第一种酶的单酶切片段数为F1，第二种酶切片段数为F2，双酶切的片段数为F，则线形DNA的F=(F1+F2)-1，而环状DNA的F=F1+F2。

② Fd通常等于几个Fl之和。

（二）重组子的酶切分析

重组子是插入了外源DNA片段的载体分子。与空载的载体相比，其酶切图谱出现了变化。所以，检测疑是重组子的酶切图谱可以帮助确定是否是真的重组子，并可以确定插入片段的插入方向，为基因克隆的结果鉴定和进一步的操作提供依据。

三、实验内容

（一）酶切图谱的构建

1、用两种限制性内切酶分别对同一DNA分子进行完全单酶切。

2、取适量的单酶切产物用另一种酶进行完全酶切，得到双酶切产物。

3、将以上酶切产物进行电泳，然后分析电泳结果，构建这两种的酶切图谱。

（二）重组子的酶切分析

1、提取疑是重组子的DNA，并用适当的限制性内切酶进行酶切。同时做非重组子对照。

2、分析酶切产物的电泳结果，绘制酶切图谱，判断是否是真重组子。

四、注意事项

1、实验前必须查阅相关资料，了解和掌握双酶切法的原理和构建图谱的方法。根据所提供的材料设计详细的实验步骤，以达到最好的实验结果。

2、实验中应确保完全酶切，并获得良好的电泳分离结果。

3、重组子分析时应在了解插入片段的一般资料的基础上确定所需的限制性内切酶，并对酶切结果作出预期；最后用实验结果进行验证。