(3)配制胶体金溶液的pH以中性(pH7.2)较好。
(4)氯金酸的质量要求上乘,杂质少。最好是进口的。
(5)氯金酸配成1%水溶液在4℃可保持数月稳定,由于氯金酸易潮解,因此在配制时,最好将整个小包装一次性溶解。
(三) 胶体金标记蛋白的制备
胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值,在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下,二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时,则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1.待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜,以除去多余的盐离子,然后100 000g4℃离心1h,去除聚合物。
2.待标胶体金溶液的准备 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L
HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时,调至9.0;标记McAb时,调至8.2;标记亲和层析抗体时,调至7.6;标记SPA时,调至
5.9~6.2;标记ConA时,调至8.0;标记亲和素时,调至9~10。
由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板,因此,在调节pH时,采用精密pH试纸测定为宜。
3.胶体金与标记蛋白用量之比的确定
(1)根据待标记蛋白的要求,将胶体金调好pH之后,分装10管,每管1ml。
(2)将标记蛋白(以IgG为例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml~50µg/ml,分别取1ml,加入上列金胶溶液中,混匀。对照管只加1ml稀释液。
(3)5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2h,观察结果。
(4)结果观察,对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管,均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量,即为该标记蛋白质的最低用量,在实际工作中,可适当增加10%~20%。
4.胶体金与蛋白质(IgG)的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调
pH至9.0,电磁搅拌IgG溶液,加入胶体金溶液,继续搅拌10min,加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5%BSA使溶液终浓度为1%;1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。
5.胶体金标记蛋白的纯化
(1)超速离心法:根据胶体金颗粒的大小,标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。
用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心(20nm金胶粒用1 200r/min,5nm金胶粒用1
800r/min)20min,弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g,4℃离心1h;20nm~40nm胶体金结合物,14
000g,4℃离心1h。仔细吸出上清,沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3),将沉淀重悬为原体积的
1/10,4℃保存。如在结合物内加50%甘油可贮存于-18℃保存一年以上。
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