平衡法选择高亲和力噬菌体抗体

[器材和试剂]
 
● 链霉亲和素磁珠（DynabeadsM280,Dynal）
 
● 磁性1.5ml试管架（Dynal）
 
● 磷酸盐缓冲液（PBS）
 
● 2%脱脂奶粉PBS（2%MPBS）
 
● 生物素化试剂盒
 
● 含0.1为Tween-20的PBS（PBS/Tween）
 
● 100mmol/L HCI
 
● lmol/L Tris.pH 7.4
 
● 对数期生长的大肠杆菌TGI细胞
 
● 用于自文库甘油储存料中制备噬菌体抗体的设备和试剂
 
● 由定位突变或链改组制备的scFv突变衍生物文库
 
[方法]
 
1. 多样化的噬菌体抗体丈库中制备噬菌体抗体。
 
2. 根据厂家说明，对抗原进行生物素化。
 
3. 选择前，在1个1.5ml微量离心管中。用2%MPBS 1m1封闭150ul链霉亲和素磁珠，室温1小时。用磁性试管架将碰珠吸向一侧。弃去缓冲液。
 
4. 用2%MPBS封闭3个1.5ml微量离心管，室温1小时；而后，弃去封闭缓冲液。以3个不同浓度将士物素化抗原（总共3管）与溶于2%MPDS（终浓度）的1m1噬茼体样品（大约1012c{u/m1）进行孵育，室温振荡l小时。对于第一轮选择，抗原浓度应分别为Kd/l、Kd/10以及Kd /100;此处Kd=针对抗原的野生型抗体亲和力。

5. 每管加入50ul链霉亲和素化磁珠并在转台上孵育，室温15分钟。将试管放入磁架30秒。磁珠将移向磁体。
 
6. 抽吸上清，让磁珠留在微量离心管一侧。最好是用200u1吸头套在巴氏吸管上，再接 到真空源上进行。用PBS/Tween洗涤磁珠7次（每次洗涤用1ml），接着用MPBS洗涤2次，再用PBS洗涤1次。每隔一次洗涤就将磁珠转移到1个新的1.5ml试管中，以充分洗涤。
 
7. 用100ul 100mmol/L HCl将噬菌体从磁珠上洗脱下来，室温10分钟。将试管放入磁架30秒，沉淀磁珠。移取含有洗脱的噬茼体上清，并用1m11inol/L Trls（pH 7.4） 中和。冰上保存洗脱液。

8. 将0.75ml洗脱噬菌体加入到10ml对数生长的大肠杆菌TGl（A600约0.5） 中。4℃下储存剩余的洗脱噬菌体。
 
9. 37℃下静置孵育洗脱物-大肠杆菌混合液，30分钟。
 
10. 将1ul和10ul感染的TGl细胞在100mmTYE/amp/glu平板上铺板接种，滴定洗脱液（稀释比例分别为104和103）。
 
11. 离心剩余的细菌培养液，2700g 10分钟。将沉淀重悬于250ul 2×TY中，并在2个150mmTYE/amp/R1u平板上铺板，37℃孵育过夜。

12. 次晨，每个平板加入3m1 2×TY/amp/glu,再用弯曲玻璃棒自平板上刮取细菌。将1.4ml菌液与0.6m1 50%的甘油（无菌过滤）混合制备甘油储存料。-70℃下保存。分析产出滴定结果（步骤9）以确定哪个（从抗原农度=Kd/1、Kd/l0以及Kd /100）确定出相应的噬菌体以用于下一轮选择的改良。过去，我们依据噬菌体EUSA测定的结合性克隆阳性率或依据BIAcore测定的活性噬菌体浓度，进行判断。不过根据经验，可以通过分析产出滴度作出选择： 当产出滴度比抗原浓度下降更明显时（即当比较来自Kd/l、Kd/10以及Kd/100的3个产出滴度时），一般是结合减少的结果，那么此浓度下的噬茵体不应用于后续的选择。而应当用较高抗原浓度的噬菌体替代。我们每轮把抗原浓度平均降低大约90%倍，而在亲和力成熟的最后一轮常常使用飞摩尔级的抗原浓度。
 
13. 从来自步骤ll的合适的甘油储存料中制备噬菌体抗体；从本实验方案步骤1重复进行。