单克隆抗体技术：细胞的选择

脾细胞
 
1．材料
 
(1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。
 
(2) 1640培养液
 
(3) 2.5％FCS－1640营养液
 
2．操作方法
 
(1) 拉颈或用CO2处死小白鼠。
 
(2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
 
(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。
 
(4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。
 
(5) 直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。
 
(6) 以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。
 
(7) 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。
 
(8) 重复⑹、⑺步骤。
 
(9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。
 
骨髓瘤细胞
 
骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。
 
选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。

目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP2）；③P2—X？ ­—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO
 
以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。
 
骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。
 
由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml 8－氮鸟嘌呤。取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数。
 
饲养细胞
 
在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
 
1．材料
 
（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。
 
（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。
 
2．操作方法
 
（1）拉颈处死小鼠。
 
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
 
（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。
 
（4）用注射器将4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。
 
（5）1 000r／min离心10min。
 
（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。
 
（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。