目前动物用单抗,在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用,大多以诊断试剂(盒)的形式提供,其中核心试剂为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。
 
一、酶标记
 
1、辣根过氧化物酶(HRP)标记
 
辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基,加入抗体IgG后该醛基与 IgG氨基结合,形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合,在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了,用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。
 
程序一:
 
(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液,混匀,盖紧瓶塞,室温避光作用2小时。
 
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
 
(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水,或纯化单抗等(15mg/ml),混匀。
 
(4)称取Sephadex G25干粉0.3g,加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧,室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
 
(5)用少许PBS将交联物全部洗出,收集洗出液,加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液,混匀,室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液,混匀,室温作用1小时(或4℃过夜)。


(6)将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化,分管收集第一峰。
 
(7)酶结合物质量鉴定:
 
克分子比值测定
 
酶量(mg/ml)=OD403×0.4
 
IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62
 
克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量,一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体,标记率一般为0.3-0.6,即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上,标记率可大于0.6,0.8,0.9;OD403/OD280等于0.4时,E/P约为1。
 
标记率=OD403/OD280
 
酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性,抗体活性及效价、特异性。
 
(8)HRP抗体结合物的保存:加入等量甘油后,小量分装-20℃存放,防止反复冻融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐,否则会影响酶活性。必要时冻干保存,以BSA或脱脂牛奶作保护剂。
 
程序二:
 
(1)将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中,加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液 0.1ml,室温搅拌作用1小时,以封闭HRP分子上的α和ε氨基。
 
(2)再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液,在室温中避光轻搅30分钟,溶液呈黄绿色;随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇,轻搅1小时,中止氧化反应。