乳腺上皮细胞分离培养操作步骤和注意事项

乳腺主要由腺上皮组成，早期乳汁或断奶后的乳汁含有上皮细胞团块，可用离心法收集上皮细胞（混杂有巨噬细胞），培养时常用人胚小肠纤维细胞作饲养层，可抑制间质细胞生长。使用优化培养基可使用上皮细胞传代，并形成克隆，在胶原底物上要形成三维立体的复层结构。胰岛素，氢化可的松，霍乱肠毒素，EGF可促进上皮细胞生长。体外培养中，乳腺上皮细胞具有乳腺细胞的功能，可用于确定免疫标记物类型，这些细胞可被SV40病毒转化，可用于研究正常乳腺细胞与乳腺癌细胞的区别，还是研究癌基因引起细胞转化的重要材料。

1、操作步骤

①取材。于产后2～7天在病房收集乳汁，用无菌水擦洗乳头，用手压乳房使乳汁流入无菌容器，每人可收集10～20ml乳汁，以1：1的比例与培养基混合，以利离心。

②以1000～1500r/min 离心20min，仔细去除上清。

③用培养基将细胞清洗2～4次，直至上清液不浑浊为止。

④将离心洗涤的细胞沉淀，用培养基3～5ml制成细胞悬液，接种培养瓶（平皿或板）中于37℃，5%CO2下培养。

⑤3～5天更换培养基，换液2次后大约6～8天可见克隆形成，并且扩大，开始可见有滋养作用的巨噬细胞，以后逐渐消夫（培养基最好是无血清MCDB170，也可用含牛血清，胰岛素，氢化可的松等的Eagle培养基）。

⑥待细胞长满后，用0.2%胰蛋白酶消化5～10min，洗去消化液，以1：3比例分瓶僻传代培养。

2、用乳腺细胞培养上皮细胞时需注意事项

①尽可能去除脂肪组织，用无钙，镁离子的PBS清洗（200U/ml青霉素，200ug/ml链霉素）3～5次，将组织剪成碎块，移入离心管，用吹管吸打分散，静置3～5min，使乳腺细胞及细胞团块沉积管底，脂肪，纤维等碎块悬浮上层，吸除上层液，补加洗液重复3～5次，最后用培养基重悬细胞，用3～4层无菌纱布过滤，调整细胞密度后分瓶培养。

②如果标本中纤维组织较多，可用胶原酶消化法获取细胞。

③开始有巨噬细胞存在，可作滋养细胞，随着上皮细胞的生长和克隆形成，巨噬细胞逐渐消失。

④培养时可用经照射或用丝裂霉素C处理过的3T3细胞作饲养层细胞。也可用胶原层，既利于上皮细胞生长，又利于从底层分离。

⑤培养基中也可加刺激生长因子如EGF，胰岛素，氢化可的松，猪促乳素和前列腺素E1等，有利于细胞生长繁殖。