肺泡上皮细胞的分离步骤

一、取得完全无血液残留的肺脏：

实验前j将大鼠全身血液放净，取得完全无血液残留的肺脏

二、消化肺组织：

常用于细胞消化的酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶。胰蛋白酶是最早用于消化、分离上皮细胞的酶，现在一般用损伤性小的弹性蛋白酶来替代胰蛋白酶。但这种酶却有活性不稳定，有效作用时间短暂，容易自我降解等问题。Dobbs L G等认为弹性蛋白酶能更有选择性的消化分离上皮细胞[9]。胰蛋白酶消化没有选择性，会带来像内皮细胞和间质细胞等一些不能在后面的分离步骤中去除的杂质细胞，因此弹性蛋白酶更有助于提高上皮细胞的纯度和产量。与此相反，Cunningham A C等发现，与弹性蛋白酶相比，用胰蛋白酶可以获得更大产量的Ⅱ型上皮细胞[10]。胶原酶可以用来辅助消化细胞间质。用几种酶混合的方法比单一酶消化效果更好，但目前还没有文献定量描述最优化的酶消化方法。Finkelstein J N等发现可以通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化，或把肺组织剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的实验中也证实了通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。

三、分离纯化细胞：

上皮细胞的分离纯化技术经过二三十年的发展日渐成熟，呈现多样化的特点。目前对细胞的分离纯化主要有以下几种方法。

1、密度梯度离心：

密度梯度离心分离细胞的原理是不同细胞的沉降系数不同，在密度梯度离心中细胞所处的位置也相应不同。这是最早用于分离Ⅱ 型上皮细胞的方法，至今仍在使用。用ficoll或percoll不连续梯度离心，猪肺泡Ⅱ型细胞最终纯度可以达到70%～85%左右[11-12]。沉降系数与细胞的直径和天然密度有关。由于Ⅱ型细胞与其他细胞存在密度和大小的交叉(如巨噬细胞)，仅仅通过离心并不能有效去除杂细胞。 Kikkawa(1974)让巨噬细胞吞噬一些重颗粒(如硫酸钡)，改变其密度，可以帮助区分巨噬细胞和上皮细胞。离心后的纯度达到94%,但产量明显减少[8]。上皮细胞的大小和密度变化范围较大，用密度梯度离心要丢掉和其他细胞重叠的细胞层，这必然会造成某些密度大的Ⅱ型细胞损失，产量大大降低。

2、滤膜分离：

滤膜分离的原理是根据细胞的大小不同来进行分离。Ⅱ型上皮细胞约10μm，比巨噬细胞(约25μm)和Ⅰ型细胞 (50μm-100μm)小，用150μm孔径的滤膜初滤除去大的组织碎片，30μm-40μm孔径的滤膜除去全部Ⅱ型细胞和部分巨噬细胞[13]，采用 15μm的滤膜精滤。用滤膜分离操作简单，它和其他分离方法联合使用可以提高纯度。

3、流式细胞技术：

流式细胞技术分离的原理是根据不同细胞之间的荧光差异。根据不同种细胞的特征识别，用荧光物质标记筛选。上皮细胞内含有丰富的脂类物质，用亲脂性荧光素标记，可以得到纯度很高的细胞。Funkhouser J D等用抗Ⅱ型上皮细胞的单抗进行免疫荧光标记，再用流式细胞仪进行筛选，得到96%的Ⅱ型上皮细胞[14]。但荧光素对被标记细胞有害。Rochat T R等发现自然荧光和直角光散射可以区分巨噬细胞和单核细胞，这给不经荧光标记分离上皮细胞提供了可能[15]。流式技术分离细胞的产量很低，但纯度极高。这种技术经过完善在将来会更有吸引力。

4、免疫黏附：

免疫黏附的原理是各种细胞的膜表面有不同的免疫活性物质。巨噬细胞和其他大多数非Ⅱ型细胞表面都有IgG上的Fc片段的受体。Uhal(1989)用IgG包被塑料板，把细胞悬液置于板上，巨噬细胞和其他大多数非Ⅱ型细胞因为含有Fc片段的受体而与IgG结合，吸附到板上，不黏附的Ⅱ型细胞被冲洗下来[16]。经过多年的摸索，这种方法近几年已开始应用，简便易行，可除去绝大多数的巨噬细胞，有效的提高上皮细胞的纯度。

5、贴壁选择：

贴壁选择的原理是各种细胞完成贴壁的时间不同，这种特性用在培养时做筛选。根据最终目的，综合其中几种方法能达到较好的效果。例如先用滤膜过滤，再用IgG包被法。