间接炭凝集试验

实验概要

本文以马副伤寒性流产为例介绍了间接炭凝集试验(indirect carbonal agglutination test)的原理及操作流程。

实验原理

该血清反应是以炭粉颗粒为载体，将已知的马副伤寒性流产血清吸附在该载体表面上，形成抗体炭粉结合物，即为诊断马副伤寒性流产用的炭粉致敏血清。炭粉致敏血清与相应抗原相遇时，在电解质的参与下，二者发生特异结合，便形成肉眼可见的炭微粒凝集块，液体变得清朗，即为阳性反应。如果二者不结合，炭粉则堆积于液滴中央，成为一个摇而不散的黑炭团，即为阴性反应。

主要试剂

1. 炭粉：炭粉的粒度最好在0.015～0.125mm的范围内，如达不到这个标准，用前需做预处理，常用的方法是离心法。即取30g炭粉放入大离心管中，加蒸馏水100ml，边摇边研磨，直至均匀的分散开为止，然后以300 r/min离心3～5min，弃去沉下的粗炭粉，取含细炭粉的上液以3 000 r/min离心30min，去上清液，沉于离心管底的沉淀物，即为供致敏用的湿炭粉。此外，也可用过筛法处理炭粉，即将木炭粉置乳钵中研磨后，再用300目的标准筛过筛，收集筛后的炭粉备用，用此法筛选的炭粉颗粒较大，适合于以塑料盘做反应时应用。

2. 马副伤寒性流产高免血清，pH值6.4 PBS，被检抗原等。

实验步骤

1. 致敏炭血清的制备：取湿炭粉0.25g，加1∶400稀释的马副伤寒性流产高免血清(以马流产沙门氏菌制备H抗原，免疫家兔制成，效价不低于1∶5 600，56℃ 30min处理，用前用pH值6.4 PBS稀释)3ml，混匀后，于37℃水浴中致敏60min，其间不断振摇，取出后，以3 000 r/min离心10min，去上清液，向沉淀物中加入pH值6.4 PBS 5ml，以3 000 r/min离心10min，去上清液，按同样的方法洗一次后，再往沉淀物中加1%兔血清(56℃ 30min灭活)、1%硼酸pH值6.4 PBS 5ml，混匀，以3 000 r/min离心10min，去上清液，最后向沉淀物中加入1%兔血清、1%硼酸pH值6.4 PBS 3ml及1%硫柳汞溶液0.03ml，充分混匀后，即为诊断马副伤寒流产用炭血清。

对照用炭正常血清的制备，系以56℃ 30min灭活的正常家兔血清代替马副伤寒性流产高免血清，按上述方法制备。

2. 操作方法：取20×40cm玻璃板一块，用1ml吸管往玻璃板上依次滴加不同稀释度的马流产沙门氏菌肉汤培养物0.1ml，对照用溶液0.1ml。再用另一支1ml吸管往每一滴菌液中及对照的液滴中滴加免疫炭血清及正常炭血清0.05ml，用小木棒充分搅拌，在1～5min内按以下标准判定结果。

注意事项

1. 炭粉粒的大小对试验影响较大，使用的炭粉不符合标准时，应作预处理。

2. 使用的免疫血清效价要高，低时，使用前的稀释倍数也应相应地降低。