多重 PCR反应的基本原理
DNA 引物（步骤 1 和 2 ） . 引物的选择遵从简单的规则：引物长度为 18-24bp 或更长， GC 含量为 35%-60% ，退火温度 55 ℃ -58 ℃或更高。长些的引物（如 DMD 基因的引物， 28-30bp ）使反应在更高的退火温度下进行并产生较少的非特 异性产物。使用软件 Primers 1.29( 从 ftp.bio.indiana.edu 下载的免费软件 ) 来计算熔点并检测可能的引物间的相互作用。使 用 BLAST 工具在 NCBI 序列数据库中对多对引物进行比对，以检测可能的重复序列。
单基因的 PCR( 步骤 3). 首先设计了一个分别单独扩增所有基因的 PCR 程序。反应混合物包括： 1xPCR 缓冲液， 0.4 μ M 引物， 5% DMSO 和 1U Taq DNA 聚合酶，共 25 μ L 反应体积。将在同一台 PCR 仪，在同型号的不同 PCR 仪上，在不同型号 PCR 仪上及在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果进行比较。在同一台 PCR 仪上或在同型号的不同 PCR 仪上扩增，实验的重复性很好，但在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果有明显差异，但是通过对循环条件的调节可以得到好的重复性。实验表明对于 100-300bp 的基因扩增产物，通过降低延伸温度可以增加某些产物的产量。对于单一 PCR 反应，退火时间与延伸时间并不明显影响结果，但改变退火温度可以改变 PCR 产物的特异性和产量。对于扩增 22Y 特异基因 (Figure 2a) ， PCR 程序 A 得到最佳结果 (Table 2) 。
多重 PCR ：等物质量的引物混合物（步骤 4 ） . 将引物以各种方式混合在同一反应中同时扩增多个基因要求对某些反应参数进行改变或优化 (Table 1 和 Figure 2b) 。初次进行多重反应时，各种引物按相等的摩尔数添加是很有必要的。结果将会揭示哪些引物的浓度或是哪些参数需要改变。下面将解释并讨论一些优化的例子，由于许多参数被提及不止一次，因此这些例子并未严格遵照 Figure 1 中所列的步骤。
多重 PCR反应循环条件的优化
延伸温度（步骤 5 ， A-C ） . Figure 2c 展示了当加入相等量 (0.4 μM each) 的四种用于扩增 Y 染色体上不同基因的引物进行多重 PCR 时，用程序 A 和程序 B 扩增得到的结果 (Table 2) ，程序 B 有更高的延伸温度 (72 ℃ ) 和更长的退火和延伸时间。总的来说，用程序 A 对 Y-1, Y-3* 和 Y-4 的扩增得到了更高产量的 PCR 产物。此外，用程序 B 扩增时某些产物消失 (Y-1 、 Y-2) ，同时出现了某些非特异性的扩增产物 (Y-1 、 Y-3*) 。程序 B 得到的结果更差一些，表明高的延伸温度减少了某些基因的扩增，尽管我们试图用长的退火时间和延伸时间来消除这种影响。
延伸时间（步骤 5 ， A, B 和 D ） . 在多重 PCR 中，由于同时扩增多个基因，酶和 dNTP 的缺乏就成为限制因素，就需要更多的时间来完成所有产物的合成。两个实验表明了延伸时间的影响。在一个实验中，一对 Y 染色体引物 (Y6BaH34pr, 910bp) 被加入 X 染色体引物混合物 (X-3) 中。结果表明 (Figure 3b) ，多重 PCR 中增加延伸时间 ( 程序 A 与程序 D) 可以增加较长的 PCR 产物的产量。在另一个实验中，用程序 C 和 A （ Figure 3a 和 Table 2 ）扩增四个 Y 染色体上的基因。当延长延伸时间时，所有基因的 PCR 产物量都增加了。
退火时间和退火温度 （步骤 5 ， A-D; Figure 1 ） . 将退火时间从 20 秒改为两分钟并未改变扩增效率，但退火温度却是最重要的参数之一。尽管许多基因能在退火温度为 56 ℃ –60 ℃被特异的扩增，我们的经验表明 将退火温度降低 4 ℃ –6 ℃对于在多重 PCR 中扩增出同样的基因是必需的。 Figure 3, d–f 展示了这种情况，单独扩增时退火温度为 60 ℃的基因在多重 PCR 中退火温度为 54 ℃时最优。尽管在 54 ℃时可能出现非特异性扩增（如 Figure 3c ），但多重反应中并发的其他基因的特异扩增会消除非特异性扩增的影响。相似的，当同时扩增许多特异的基因时，扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低。这是由于在 PCR 反应中酶和 d NTP 的供应是有限的，所有的产物都是由同样的一组原料生成。
PCR 循环数 . 引物混合物 Y-3* 被用于扩增两个不同的基因组 DNA 样品，以不同的循环次数做多次实验 (Figure 4a) 。其中的一个基因组模板质量更高或 DNA 含量更高。可以看出，当循环数增加时，两组样品的各扩增带的产量都逐渐增加。 PCR 产物量增加最明显是在 25 个循环附近。通常对于一个反应， 28 至 30 个循环足矣，增加至 60 个循环对产物量无明显影响。
多重反应中试剂组分的优化
当使用同样的扩增程序时，不同的实验间存在差异 (Figures 2c 和 3a) 。解决重复性问题要求调节 PCR 反应组分。
引物的量 ( 步骤 5, B 和 C). 最初，在多重 PCR 反应中使用了相等物质量的引物（每种引物为 0.2–0.4 μ M ） (Figure 3c) 。但是扩增并非均一的，即使在优化了循环条件后，某些基因的扩增产物仍不明显。解决这一问题，要求改变反应中各种引物的比例，要增加"弱"基因的引物量，而要减少"强"基因的引物量。不同基因相对的引物终浓度有明显的差异 (0.04–0.6 μ M) ，这完全取决于经验。