ctDNA甲基化检测在肿瘤诊疗中的价值

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）来源于肿瘤细胞的凋亡、坏死或分泌产生的DNA片段，是循环游离DNA（circulatingcell-free DNA，cfDNA）的一部分。健康人群中大部分cfDNA的长度在70~200 bp，但肿瘤患者的ctDNA长度可能为200 bp甚至超过1000 bp。ctDNA含有与其来源肿瘤DNA同样的基因缺陷，如点突变、重排、扩增、微卫星改变、表观遗传修饰等。当肿瘤DNA进入血液时，这些基因缺陷模式在血浆和血清中也可被检测到。

甲基化是DNA的一种重要修饰，是指在DNA甲基转移酶的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。哺乳动物中DNA甲基化主要发生在CpG双核苷酸的C上，生成5-甲基胞嘧啶（5mC）。人基因组中60%~90%的（CpG）都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，主要位于基因的启动子和外显子区域，长度为300~3 000 bp。靠近或位于启动子区域的异常甲基化一般会抑制转录，沉默相关基因的表达。在肿瘤中，抑癌基因和DNA修复基因启动子区域的异常高甲基化使得抑癌基因沉默和修复基因失活，从而丧失对肿瘤发生的抑制作用，也是目前肿瘤甲基化研究的主要方向。与其他基因缺陷模式相比，DNA甲基化作为最早发现的表观修饰途径之一，其异常甲基化模式在不同肿瘤组织中具有高度特异性。特征性的甲基化"指纹"图谱可用于癌症早期诊断与分期、疗效评估、复发监测和预后判断等。

ctDNA甲基化检测在癌症诊疗应用中，基于血液标本一定程度上可以克服实体瘤组织标本的局限性，例如：（1）ctDNA在血液中半衰期短，可以实时反映肿瘤的动态变化；（2）可以克服肿瘤组织取样的异质性；（3）重复活检可以追踪肿瘤的克隆演变；（4）可以识别转移性肿瘤。因此，在过去的30年中，DNA甲基化被认为是有希望检测癌症的生物标志物[1]。

一、ctDNA甲基化检测技术方法及研究思路

1．常用检测方法及技术难点：

目前，ctDNA甲基化标志物的研究思路已经比较明确。首先，通过芯片或二代测序对肿瘤组织和正常组织进行全基因组范围的甲基化信号扫描，寻找肿瘤特异的甲基化标志物位点；然后再针对这些位点对ctDNA进行性价比更高的靶向测序，验证标志物性能。虽然研究思路比较清晰，但甲基化检测技术的诸多局限也一直困扰着研究人员。一方面，血液ctDNA含量很低，某些特定类型的肿瘤或中晚期肿瘤有可能达到20 ng/ml。技术上最大的挑战是需要从含有不同数量cfDNA的血液样品中鉴定极少量的ctDNA。另一方面，目前甲基化检测技术基本上均基于亚硫酸氢盐（bisulfite，BS）使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶（C）脱氨基转变成尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（mC）保持不变。目前基于BS的甲基化检测技术主要包括PCR扩增、测序以及基于杂交的捕获技术[2]，其中扩增的应用较广泛。BS处理后未甲基化的C变U，PCR扩增后U配对T，因此扩增后DNA变为富含A和T（AT-rich），与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来。但是，研究发现扩增过程中甲基化状态的DNA（GC含量高）易产生扩增偏好，在文库中富集。所以，需要在高效捕获BS DNA片段的同时，还要保证甲基化信号在扩增过程中均匀放大，不走样。

2．近年来研究思路的突破方向：

过去研究多聚焦于单基因启动子区甲基化，研究发现多基因组合检测可以进一步提高DNA甲基化特征的特异性和敏感性。随着生物信息技术的快速发展，甲基化检测逐渐由单基因向多基因组合以及全基因组水平拓展。2017年Nature Genetics杂志发表的一篇文章定义了147 888块紧密耦合的CpG位点，称为甲基化单倍体块（CpG methylation haplotypes block，MHB）。经过对61个全基因组BS测序数据集进行分析，并使用101个BS测序数据集和637个甲基化芯片数据集进行验证，证实大小为95 bp并含有≥3个CpG位点的MHB在大约170 bp的cfDNA中更容易被检测到。最后使用MHB对59例肺癌或结直肠癌患者的肿瘤组织和循环cfDNA进行了评估，发现借助肿瘤特异的MHB模式可以进一步提升甲基化指纹的准确性，从痕量检测中发现甲基化的组织来源[3]。2017年，通过机器学习对全基因甲基化谱进行分析后，发现了4种常见肿瘤的特异性甲基化分子标志物，包括肺癌19个、结直肠癌6个、乳腺癌15个、肝癌3个。这些标志物能够从正常组织中区分出肿瘤，准确率大于95%。进一步对结直肠癌30例肝转移灶和34例肺转移灶进行无监督分层聚类分析，发现高度组织特异性的甲基化特征可以正确诊断肿瘤起源，诊断正确率分别高达96.7%和94.1%[4]。与上述研究方法类似，研究人员在大样本肝癌研究中筛选出10个甲基化标志物，建立起血液肝癌的ctDNA甲基化诊断模型。经证实该模型可以区分正常人群、肝病背景（肝炎，肝硬化等）和肝癌患者，并与肝癌的肿瘤负荷、治疗反应和临床分期关联良好，再次证实了ctDNA甲基化检测的临床优势[5]。

二、ctDNA甲基化检测的临床应用

1．ctDNA反映基因启动子区高甲基化的一致特征，可以用于肿瘤诊断：

与DNA突变相比，基因特定启动子区域的异常甲基化可能是癌症的一致特征，例如，90%的前列腺癌中谷胱甘肽S-转移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）基因被甲基化[6]，96%的乳腺癌中分层蛋白（stratifin，SFN）基因被甲基化[7]，同源框蛋白A9（homeoboxA9，HOXA9）基因和锯齿状同源框蛋白1（engrailed homeobox 1，EN1）基因分别在95%和80%的卵巢肿瘤中被甲基化[8]，73%的肝细胞癌中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）基因被甲基化[9]。高度一致的甲基化特征使得ctDNA甲基化广泛地适用于肿瘤诊断。用于诊断的商业产品也已经面市，如基于粪便的结直肠癌筛查试验将N-myc下游调节基因4（N-mycdownstream regulated gene 4，NDRG4）与骨形态发生蛋白3（bone morphogenetic protein 3，BMP3）基因的甲基化改变与突变检测相结合，在2014年获得了美国FDA批准，是第一个基于DNA甲基化检测的诊断试验[10]。此外，Epi proColon检测分析Septin 9基因的甲基化用于全结直肠癌筛查[11]，以及Epi proLung检测分析矮小同源盒蛋白2（short stature homeobox 2，SHOX2）基因甲基化用于肺癌筛查由中国FDA于2015年7月批准[12]。

2．ctDNA甲基化检测反映肿瘤负荷变化，可用于监测治疗反应：

癌症特异性ctDNA甲基化模式可用于定量肿瘤DNA，提供有关肿瘤负荷水平的信息。研究表明周期素依赖性激酶抑制因子2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）基因中位甲基化指数（甲基化的循环CDKN2A/总循环CDKN2A）由术前35%下降为术后3.5%[13]。在44%~68%的食管癌患者的肿瘤中检测到APC基因的甲基化[14]，食管癌患者术后血液中腺瘤性结肠息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）基因甲基化水平与术后肿瘤残余显著相关[15]。

除了反映手术后肿瘤负荷的下降，ctDNA甲基化还可以反映肿瘤对化疗药物的反应。目前，大多数转移性恶性肿瘤需要至少3个周期的化疗，然后才能根据常规成像和生物标志物来评估治疗反应。这种延迟使许多患者暴露于不必要的药物毒性下，并延误其他潜在有效的治疗时机。早期检测对治疗药物的反应对于改善肿瘤患者结局是必不可少的，目前常规监测主要通过检测血液蛋白质生物标志物来进行。ctDNA甲基化检测反映肿瘤负荷变化的特征使其有望成为监测治疗反应的新方法。一些研究报道了在化疗期间多个时间点使用ctDNA甲基化定量来监测肿瘤动态，例如使用血浆中ctDNA甲基化GSTP1来追踪前列腺癌患者对化疗的反应。在35例接受多西他赛或米托蒽醌治疗的探索性患者队列中，首次化疗后2~38个月（中位数15个月）内血浆甲基化GSTP1水平升高，随后前列腺特异性抗原（prostate specificantigen，PSA）水平升高，表明血浆甲基化GSTP1可能是较PSA更好的总生存率预测指标[16]。Fackler等[17]通过全基因组甲基化芯片筛选和TCGA数据缩小范围，最终选择了10个基因的甲基化标志物用以区别乳腺癌和健康对照，然后通过追踪使用多西他赛和伊马替尼或卡培他滨治疗的29例乳腺癌患者血清中上述标志物的甲基化水平，发现治疗1~2周后上述组合甲基化水平降低，患者疾病稳定或部分缓解，无疾病进展。持续追踪观察到在临床疾病进展之前可以检测到ctDNA甲基化水平升高。此外，血清Ras相关区域家族1A（rasassociation domain family 1A，RASSF1A）和维甲酸受体β2（retinoicacid receptor beta 2，RARB2）基因甲基化水平还被发现能指示肺癌治疗反应[18]。

尽管上述研究将ctDNA甲基化降低与肿瘤体积减小相关联，从而评估化疗敏感性，但考虑到血液中ctDNA的半衰期只有2 h，可以提供非常快速的针对肿瘤状态变化的测量，2015年Wang等[19]采取了不同的思路，使用甲基化ctDNA的增加来评估化疗诱导的肿瘤细胞死亡的程度。结果显示24 h内循环甲基化RASSF1A或APC1的增加与完全/部分化疗响应相关，而治疗后两个标志物没有变化与肿瘤稳定/进展相关。这些ctDNA甲基化变化的不同方向可以通过化疗诱导细胞死亡导致ctDNA的初始水平激增来解释。与升高时间相比，化疗后ctDNA甲基化下降时间的范围从1周到1年不等，这些波动强调了对化疗作出反应时详细表征ctDNA动力学的重要性。

3．ctDNA甲基化检测可反映肿瘤的预后、侵袭和复发：

甲基化可以通过沉默调节细胞生长和转移潜能的基因来促进肿瘤进展，还可以反映肿瘤亚型，所以其又与肿瘤预后相关联，许多研究用以指示肿瘤侵袭和复发的可能性。ctDNA甲基化与肿瘤预后的研究中，所选基因在癌症相关过程中功能已知，如细胞增殖，凋亡等，例如胃癌中X连锁凋亡抑制蛋白相关因子1（X-linkedinhibitor of apoptosis protein associated factor 1，XAF1）基因的甲基化与生存率下降有关，手术后甲基化XAF1患者和非甲基化XAF1患者的中位无病生存期分别为23.4个月和39.6个月[20]。性别决定区Y基因盒17（sexdetermining region Ygene box 17，SOX17）基因通过调节WNT信号传导途径发挥抑瘤作用，其表达抑制能够促进肿瘤发生。两组研究报道了血液中SOX17甲基化与食管癌和胃癌的预后不良有关。在40例食管癌患者队列中，使用包括SOX17等在内的8个基因的启动子和外显子1区的9个CpG甲基化探针用于预测预后，发现SOX17是多变量分析中的独立预后因素[21]。在另一组73例胃癌患者队列中，血清SOX17甲基化与肿瘤分化以及总生存期相关[22]。RARB2是一种视黄酸受体，通常发挥抑瘤作用，其甲基化一直被证明与结直肠癌、乳腺癌和肺癌预后不良相关[18]。在胃癌中，RUNT相关转录因子（runt related transcription factor 3，RUNX3）基因术前血清甲基化水平在晚期阶段高于早期阶段，且复发病例术前血清RUNX3甲基化明显高于非复发病例，很可能是由于ctDNA甲基化水平反映了肿瘤负荷。此外，评估血清RUNX3甲基化和CEA可改善对结直肠癌的诊断[23]。

综上，ctDNA甲基化能克服现有肿瘤标志物特异性差，假阳性率高的缺点，在临床应用方面展现出广阔前景。但是，我们也应该意识到ctDNA甲基化检测距离真正进入临床实践还有很长的路要走。主要应注意以下几点：（1）因为临床试验中抗肿瘤的疗效评价需要长期随访收集完整的治疗信息和预后信息，目前在临床上存在较大困难。ctDNA甲基化检测应注意样本收集的时间点，如治疗前后对比来评估疗效，甚至治疗全程多时间点依次收集样本来监测病程。（2）ctDNA在血液中半衰期较短，其甲基化动力学变化应纳入考虑。（3）技术进步使得检测数万个CpG位点成为可能，但是全基因组ctDNA甲基化检测技术对生物信息学提出了更高的要求。（4）ctDNA甲基化标志物的诊断效能仍需与其他癌症循环生物标志物进行比较。未来ctDNA甲基化检测可用于癌症个体化实时诊治，包括癌症筛查、诊断、疗效监测及预后判断。