2012中国医学科学院蛋白质组学研讨会大会报告

　　2012中国医学科学院蛋白质组学研讨会于2012年11月28日在北京召开，来自相关领域的专家学者300余人出席了本次研讨会。会议邀请了强伯勤院士、何大澄教授等8位从事蛋白质组学及疾病研究领域的著名学者，作了关于蛋白质组学和基因组学、代谢组学等相关的精彩报告。主办本次会议的单位是中国医学科学院基础医学研究所，另外大会得到著名质谱公司AB SCIEX 公司的独家赞助及分析测试百科网(www.antpedia.com)的独家媒体支持。会务组为本次大会设立了抽奖环节，让学术性会议也出现了激动人心的时刻。以下是具体报告内容：

　　中国医学科学研究院基础医学研究所 强伯勤院士

　　首先是来自中国医学科学研究院基础医学研究所的强伯勤院士作报告，报告题目是《基因组研究与转化医学》。主要内容如下：

　　目前，我国在人口与健康密切相关的卫生保健事业已经取得了很大的成绩，然而防病治病任务依然十分繁重，主要表现在：1.多种慢性非传染性疾病，如心、脑血管病、肿瘤等，已日益成为威胁人民健康的因素；2.伴随工业化、城市化进程所发生的环境污染、职业性危害和营养失衡性疾病以及性病、艾滋病、意外伤害呈上升趋势；3.人口增长和老龄化、疾病谱的变化、先进医疗技术和药品更新换代等因素形成卫生费的不断上升。

　　人类基因组工作框架图

　　2000年人类基因组工作框架图发表，2006年3月第1号染色体全序列正式公布，标志着人类基因组DNA全序列测定的目标已基本完成。绘制人类基因组SNP单体型图谱(HapMap)的国际合作第一阶段的任务已基本完成，识别人体内所有基因的结构与功能，解读包括非编码序列在内的人类遗传物质的全部信息，已是人类基因组研究的主要任务。人基因组全序列测定的完成仅提供了一位个体遗传信息的基础数据。要解释遗传因素与疾病的关系，提高人体的健康水平，尚需多方位、广角度地深入开展基因组学研究，强化转化医学研究。单人基因组全序列测定完成后，基因组研究的新任务包括：1.比较基因组学与生物进化；2.应用基因组学：动、植物基因组学测序与品种改良；工业微生物基因组；生物质能源等；3.新技术、新方法(包括测序)生物信息学；4.识别人体内所有基因的结构与功能，解读包括非编码序列在内的人类遗传物质的全部信息。基因组多态性、变异研究以及与人类疾病的关系，医学基因组学与系统生物学研究。

　　国际人类基因组单体型图计划

　　“单体型图”是人类基因组的遗传“差异”。即个体表现型差异，即所有性状，特别是对疾病以及病源与药物反应性差异的遗传基础。一共有三个阶段：HapMap1 (2005完成) HapMap2 (2007完成)、HapMap3 (2010完成)。

　　国际肿瘤基因组计划

　　美、中、加拿大、欧洲及印度等国一起成立了“国际肿瘤基因组协作组(ICCG)”，计划分析50种肿瘤的500个样品。目前的预算为10亿美元，参与国要许诺5年共20000万美元的经费投入。北大肿瘤医院的吕有勇教授承担胃癌的任务。

　　人类基因组序列图谱的绘制、肿瘤基因组计划的实施将有可能使人们首次从基因组水平洞悉癌细胞、癌基因与正常细胞、正常基因的差异，进一步了解肿癌的发生、发展、癌细胞转移等机理，有助于癌症的早期诊断和预警，并帮助确定不同患者的不同治疗方案。

　　测序是基因组学的核心技术

　　美国对测序技术的开发投入很大。2010年初，Helicos BioSciences已获得HIH的290万美元资助，Pacific Biosciences获190万美元，另外有共1300万美元用于纳米孔测序、蛋白质纳米孔和其它新测序技术。

　　转化医学

　　转化医学的目的是打破生命科学、基础科学与临床医学、预防医学、药物研发和健康促进之间的人为屏障，建立彼此之间的直接关系，缩短从实验室到病床的过程，将基础研究获得的成果快速转化为临床应用，人群预警方案，药物研发和健康保障。基于基因组的转化医学研究包括：1.临床样本收集和个体标本库的建立；2.单基因遗传病致病基因发现；3.复杂性状疾病易感基因的鉴定；4.疾病相关分子标志物筛查、鉴定与应用；5.基因诊断与基因治疗；6.药物靶标与药物筛选。

　　罕见单基因遗传疾病

　　单基因遗传疾病包括；常染色体显性遗传疾病，例如多指病、并指病、软骨发育不全症；常染色体隐性遗传疾病，例如白化病、苯丙酮尿症；性染色体遗传(X连锁显、隐性遗传疾病)，例如抗维生素D性佝偻病、进行性肌营养不良、红绿色盲症。

　　复杂性状疾病的易感基因研究

　　多基因复杂性状疾病是涉及多因素、多基因的复杂作用过程。目前在多种复杂性状疾病中已鉴定出数目不等的易感基因。足有不同遗传背景的个体可具有相同的疾病表型(疾病易感性)；而具有相同相似遗传背景的个体会出现不同的疾病表型。

　　基因诊断和基因治疗

　　国际上疾病基因治疗方案已达1500种，以肿瘤治疗为主。在目的基因的选择、基因转移运载体系、目的基因表达及其调控方面都有进展。基因治疗与其他治疗方案相结合的综合治疗方案将是重要发展方向。

　　北京师范大学 何大澄教授

　　北京师范大学细胞生物学研究所首批特聘教授何大澄教授，《动态蛋白质组学新技术及其在肿瘤研究中的应用》

　　动态是蛋白质组学的灵魂

　　基因组是蛋白质组的一上游，基因组是基础。蛋白质虽然是从基因编码出来的，但与基因组有非常大的不同。最大的不同就是，虽然基因有许多分型和表现、突变，但基因组是不变的，每一个细胞里的基因组都是一样的；但是严格地说蛋白质是非常不一样的，粗分有260多种，细分有600多种，即使是同一个细胞，在细胞的生命过程中，几乎每一个小时、每一分钟都不一样。

　　所以研究蛋白质组的时候,哪些蛋白在什么地方什么时候，发挥什么样的功能，怎样发挥这样的功能，为什么能够发生这样的功能。这真正是蛋白质组学要做的事情，所以蛋白质组学完全不是一些单板的物件在那里，它们是很多活的东西在一个舞台上表演，动态就是它的灵魂，没有动态，蛋白质组学就没多大意义了。

　　这两点很重要：

　　第一，在不同的细胞里边去研究，而且是研究动态，这是蛋白质组学的灵魂；

　　第二，不是在芯片上，也不是在试管里，而是在细胞里研究蛋白质组学。

　　放射性35S标记体内蛋白动态分析(SiLAD)有以下几个主要步骤：

　　1. 放射性35S脉冲性标记蛋白质，体外15分钟标记，体内30分钟标记。

　　2. 蛋白质被二维凝胶分离

　　3. 凝胶是通过CBB染色和磷成像获得的

　　4. 不同的蛋白质被筛选和比较

　　5. 最后通过MS/MS进行鉴定

　　把在这些蛋白提出来以后，进行凝胶分离，然后凝胶干掉以后，去进行放射性曝光。你用Phospho-imaging去取得放射性元素曝光的图像，每一个蛋白点的聚焦，就能出现在胶片上。这些35S表达的点都是在这15分钟内合成的蛋白，有多少累积蛋白都会表现出来。对于这些蛋白，就可以对它们进行合成速度改变的分析。什么时候加速合成，什么时候停止合成。所以我们不是研究蛋白质累积了多少，不去看它的“仓库”里堆了多少东西，而是去看它的“车间”，机器转不转，生产的活力够不够，能够知道生理的状态、细胞的活动。

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　　中国医学科学院药物研究所 再帕尔研究员

　　来自中国医学科学院药物研究所的再帕尔·阿不力孜教授带来了题为《基于LC-MS/MS技术的代谢组学分析方法研究与应用进展》的报告。

　　再帕尔教授首先对比了NMR、LC-NMR与LC-MS、GC-MS在代谢组学分析当中的优缺点，发现在代谢组学复杂样本体系的分析研究中，建立一个可以获取全面、完整代谢物信息的LC-MS方法，首要解决的关键问题是克服质谱的离子化歧视效应，尽可能使不同类型及极性的代谢物均可实现离子化，并检测到体液中更多的内源性小分子代谢物。由于不同离子化方法针对代谢物的适用范围不同，单一离子化方式的LC-MS方法很难获取全面的代谢物信息。

　　再帕尔教授提出了“减少分离、分类分析”的研究思路，探索并建立了以电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、大气压光致电离(APPI)三种电离方式相结合的“组合式”RRLC-MS/MS新型分析方法。运用本方法结合多变量数据处理方法开展了肺癌患者尿液的代谢组学研究。

　　此外，再帕尔研究员还开展了肺癌、食管癌患者治疗前与治疗后尿液、血浆样本的代谢组学研究。结合患者临床的疗效评价，系统考察了可能生物标志物在健康状态、肺癌治疗前和治疗后三个阶段的变化趋势，共鉴定了27个潜在生物标志物结构，并寻找到了一些与疗效相关的生物标志物，有望为肺癌的临床疗效评价和预后判断提供重要依据。

　　在药物代谢组学研究中，再帕尔教授建立了动物模型的代谢组学研究，分析了肿瘤发展过程中大鼠尿液的代谢轮廓变化和差异代谢物的四种动态变化趋势，寻找与肿瘤发展相关的可能标志物。

　　在L-肉碱类代谢物及其动态变化研究中发现，L-肉碱的合成前体、L-肉碱和L-肉碱的代谢物的含量随肿瘤的发展一直上升，可能反映了癌症的进程或荷瘤大鼠的身体状态，如肿瘤恶病质状态。再帕尔教授表示，采用动物模型进行代谢组学研究，能够获得动态的代谢组学数据，并可将代谢物的动态行为分析整合到代谢组学中。这不仅可以排除与疾病不相关的差异代谢物，并且还能为生物体代谢变化提供生物学上的信息支持。

　　再帕尔教授还介绍了他与清华大学王晓浩等人合作的成果——自主设计及研发的AFAI离子源。AFAI离子源采用新型敞开式解吸离子化技术及其装置研制，是整体动物体内药物分析的质谱分子成像新方法。在抗肿瘤候选新药CAT的AFAI-IMS分析中，AFAI-IMS方法以较高的信噪比检测到CAT在不同器官中的差异分布能直观全面地反映药物在整体大鼠中的分布结果。在单器官AFAI-IMS、LC-MS/MS的比较分析中，进一步证明了AFAI-IMS在整体动物体内药物分布分析的可靠性。再帕尔教授表示，在未来AFAI-IMS可用于直接发现候选药物靶器官、预测抗癌药物的可能瘤谱，有望发展成为药物研发领域的新型手段，有望发展成为一个新型的分子诊断工具。

　　北京蛋白质组研究中心 朱云平

　　来自军事医学科学院放射与辐射医学研究所、北京蛋白质组研究中心、蛋白质组学国家重点实验室的朱云平老师带来了题为《肝脏蛋白质组生物信息学研究》的报告。朱老师从蛋白质组信息学的作用与地位、质谱信息学、数据分析和蛋白质组数据管理与展示四个方面进行了介绍。

　　朱老师表示蛋白质组研究发展趋势是各环节SOP的制定，从大规模数据产出走向数据挖掘，蛋白质鉴定从定性走向定量，研究从基础发现逐步走向临床。生物信息学是蛋白质组研究的重要支撑，同时也是其成果的集大成者。生物信息学研究策略是由知识发现平台和蛋白质组综合分析平台到数据挖掘、关键功能分子的发现、生物学网络综合分析，再到与转录组基因组的对接、重要蛋白质的发现和调控规律的发现，再到实验研究，然后将数据再返回到知识发现平台和蛋白质组综合分析平台往复循环。

　　在质谱信息学中，朱老师指出质谱数据分析的核心问题是图谱解析。人类蛋白质数据库不完整，非人类蛋白质数据库对人类蛋白数据库的补充非常有限，若想鉴定人类蛋白质数据库没有收录的蛋白，可以通过补充搜索其它数据库或搜索基因组数据库和denovo鉴定实现。 整合多特征参数可以改进Mascot鉴定肽段的质控，应用贝叶斯非参模型整合多种参数增加 Mascot鉴定肽段数，可以观察到BNP模型具有最佳的灵敏性，在0.005~0.05置信度区间内，应用BNP模型过滤得到了最多正确结果数目。根据复杂样品数据集分析结果可知BNP模型可以得到最多的过滤肽段，比仅采用MIT和MHT方法多鉴定11%-63%的高可信结果。

　　在数据分析中，朱老师分析了蛋白质丰度与保守性的关系。经过多组数据分析可知，蛋白质序列保守性与丰度呈正相关关系；在对多物种分析中，三大分子合成机器中，其组成蛋白质的丰度均表现为DNA-RNA-蛋白质依次升高。朱老师还提到了肝细胞癌相关重要分子的筛选方法和已知癌症基因的网络特征分析。

　　最后，朱老师向大家展示了Proteome View的主页面，Human Fetal Liver的鉴定蛋白，搜索示例页面，染色体浏览页面，鉴定肽段页面，实验图谱与理论图谱匹配子页面和肝脏综合知识库等质谱数据、管理与展示系统。

　　美国威斯康星大学 李灵军教授

　　专程从美国威斯康星大学赶来的李灵军教授带来了题为《质谱的分子成像及蛋白质组学在神经系统疾病研究的应用》的报告。李教授主要研究方向和领域包括生物质谱分析方法的发展与应用，微尺度分离方法与质谱的联用，质谱成像技术的发展与应用，神经分析化学，神经肽与多肽组学，蛋白质组学在神经科学与疾病研究中的应用。

　　报告中，李教授主要介绍了MALDI MSI在检测神经多肽组中的应用并以神经肽和血脂的三维成像为例，得出结论：样品的制备和模型的建立是生成组织特异性神经多肽图像的关键；详细分布的多种神经肽和血脂，可以在多种神经肽家族中同时的表现出不同的分布和共定位，如很小的神经器官；二维和三维的都可以成像。

　　MALDI-MSI成功地提供了特定区域分析和分子量的蛋白质种类的空间分布信息；高分辨率串联质谱自上而下的碎裂技术能够鉴定目标蛋白；蛋白表达模式的改变继发于NMDA受体拮抗剂和GABA能药物的治疗；这些蛋白可以作为潜在的生物标志物的神经毒性等药物，有些甚至可能构成新的治疗靶点。

　　在朊病毒疾病的生物标志物的发现研究中，李教授介绍到已被开发的有效分析平台有外源凝集素亲和色谱法、多维分离法和LC-MS/MS法。利用同位素标记和频谱计算对708个蛋白质进行了鉴定和相对定量。

　　李教授以“带回家的消息”表述了她在国外的研究成果：成像MALDI-MS已成为直接切片薄组织进行分子分布情况调查分析的一种有力工具；在没有朊病毒知识的情况下，它是唯一一个能够映射宽范围化合物的；通过MALDI-IMS提供的信息，与其他传统的生物分析工具所获得的知识(如LC-MS/MS)是互补的；以生物制剂为基础比较蛋白质组学分析，可能会导致公认的生物标志物或疾病诊断的生物分子条码的发现。

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　　中国医学科学院基础医学研究所 高友鹤教授

　　来自中国医学科学院基础医学研究所的高友鹤教授以幽默诙谐的方式为与会者阐述了《尿蛋白质组和生物标志物研究》的内容。

　　高教授首先介绍了尿蛋白具有以下特点：1.正常尿蛋白质组相对简单，病理状态下比较复杂；2.尿蛋白的影响因素比较多；3.对泌尿系特别是肾脏的反应最直接4.作为标志物和病理生理最接近5.感兴趣的多，研究的还相对较少。高教授介绍了影响尿蛋白质组研究效率的三方面因素包括：质谱、数据分析、样品。

　　目前，疾病标志物研究面临的问题：1.标志物的疾病特异性问题；2.仅比较疾病和正常样品，不能说明找到的标志物是否是这个疾病特有的3.没有实验室为了找到特异标志物可以全面地把所有相关的疾病都包括在研究中。

　　高教授等人建立了尿生物标志物物数据库：收录了目前文献报道的所有尿液中疾病标志物的研究成果。内容包括：尿液中鉴定到得所有疾病的候选标志物(人和动物模型)网址:http://122.70.220.102/biomarker，数据库中的文献和数据是2005年以后综述引用的文献，文献更新至2012年9月，这个数据库是采用人工阅读文献的方法收集生物标志物的信息，以确保其准确性。

　　这个数据库可以告诉大家哪些疾病具有相同的类似的尿蛋白标志物；这些疾病发生发展过程中也许具有相同的或者近似的生物学过程；这些生物学过程可能是什么；通过对相关生物学过程的理解，加深对疾病的理解；哪些蛋白已经失去成为特异性标志物的可能只能有鉴别诊断价值，哪些在现在的研究水平上仍然具有疾病的特异性等等。随着质谱技术和蛋白质组学方法的发展，数据库会被逐渐被更新，分析结果也会随之产生变化，这种利用数据库研究生物标志物特异性的方法，利用数据库研究疾病关联的生物过程的方法将保持着生命力。

　　通过对数据的分析发现了标志物的特异性、.标志物的可信度、动物模型的价值及

　　肾脏病的诊断方面的一些成果。现在，已经进行过研究的范围有：膀胱癌、胰腺炎、糖尿病肾病、前列腺癌、急性肾损伤、肾移植排异、造影剂肾病及肾小球疾病的鉴别诊断。

　　接下来高教授通过实验探寻了肾脏来源的蛋白质组。得到一些肾脏来源的但是血液中没有的蛋白、在正常尿液中不出现的肾脏来源蛋白及损伤后才出现的蛋白。生物蛋白样本价值宝贵需要像病例一样尽可能全面的保存，尿蛋白是一种重要的生物蛋白样本，蕴含丰富的信息，尿蛋白通过一种理想的蛋白吸附载体，可以长久的保存。最后，高教授向所有参会者广泛征集尿蛋白样品。

　　中国医学科学院药用植物研究所 胡克平教授

　　来自中国医学科学院药用植物研究所的胡克平教授作了题为《Autism Spectrum Disorder Rett Syndrome Protein MeCP2 Is Regulated by Phosphorylation》的精彩报告。

　　科学背景：Rett综合征( Rett syndrome ,RTT ) 是一种神经系统发育异常性疾病，主要累及女孩，是导致女性智力低下的主要原因之一。女孩发病率大约为 1/1000~1/1500。典型RTT的临床特征为：出生后 6～1 8个月生长发育基本正常，随后出现神经发育停滞或倒退，丧失已获得的技能(如手的功能、语言等)，头围增长缓慢，呼吸异常，出现手的刻板动作(如搓手、绞手、吃手等)，伴有孤独症样行为，此外，惊厥发作也是常见症状之一，到疾病后期还可能出现骨骼改变、脊柱侧弯及强直等。研究证实，8 0%～9 0%的典型RTT患儿存在甲基化CpG结合蛋白2(MECP2)基因突变，在不典型RTT患儿中，该基因的突变率为2 0%～4 0%。人类 MECP2基因位于Xq28，基因全长7 6 k b ，包括5端非翻译区、4个外显子以及3端非翻译区。MECP2基因具有3个显著特征：(1)内含子2很大，达6 0 k b； (2) 3端非翻译区长达8.5 k b ，域含有高度保守序列及数个多聚腺苷酸位点； (3) 与上游最近的基因有长达4 0 k b的间距。

　　胡教授通过对Rett Syndrome相关MeCP2基因的研究，提示了MeCP2对体内基因表达和表观遗传学修饰的调节是通过非Brahma-SWI/SNF染色质重建复合物依赖性的方式进行，更正了以前普遍接受的Brahma依赖性假说，并发现了MeCP2的磷酸化现象，确定了MeCP2的9个磷酸化位点，在Nature genetics,PNAS上发表了一系列相关成果。

　　胡教授介绍到：对于MeCP2的相互作用蛋白的研究，在研究之前必须寻找功能强大的抗体。对于购买已存在的商业抗体的研究发现大部分的抗体所做的免疫印迹分子量基本均不对。因此，需要制备自己的功能强大的抗体。纯化抗体的制备首先需要表达多个MeCP2蛋白片段，应用该抗体采用免疫共沉淀实验寻找与Mecp2相互做用蛋白。免疫共沉淀获得的蛋白复合物需要同过质谱分析确定免疫共沉淀获得的蛋白是MeCP2。在免疫印迹实验发现该蛋白具有两条带，从而推测其是否是具有磷酸化修饰。最后，通过质谱分析可以确定该猜测。免疫共沉淀实验结合质谱分析为蛋白质组研究提供了最好的支持。

　　AB SCIEX公司 李春波博士

　　来自AB SCIEX公司的李春波博士带来了题为《AB SCIEX的蛋白质定量技术：MRM^HR和SWATH™工作流程》的报告。简单的介绍了AB SCIEX公司后，李博士介绍了革命性的蛋白定量新技术——MRM^HR和SWATH™。

　　李博士表示MRM^HR的工作模式是TOF MS/MS数据采集后的提取信息。随着液相色谱的分离,一系列高分辨的TOF MS/MS图谱被连续采集；单个或多个高解析度的XIC在数据采集后被提取生成；之后的定量方法与MRM类似；高采集速度保证了多肽的洗脱过程中有足够的点被采集，形成高质量的XIC结果。Triple TOF™系统是唯一能够进行MRM^HR这种高分辨的，类似MRM的定量技术的质谱；它的最低定量限和线性动态范围都与高端的三重四极杆质谱相当；定量时不需方法优化；众多的碎片离子信息被采集以供选择。

　　李博士以MRM^HR对多肽进行定量为例，向大家展示了高分辨率(>；20,000)的TOF MS/MS图谱，图中显示在TOF MS/MS数据采集后，以5mDa的窗口提取生成多个高解析度的XIC；许多碎片离子可以用来挑选和/或合并。另外，高分辨的MRM能消除干扰离子；应用Scheduled MRM^HR工作流在定量肽段时具有很好的重复性；MRM^HR在定量复杂的生物样品时，具有非常好的特异性；MRM^HR还可以提供更好的定量检测范围和更高的特异性。

　　突破性的SWATH技术可以在一次实验中获得所有蛋白的定性和定量数据，实现全面的、系统的蛋白质组学研究。李博士表示SWATH™技术是蛋白质组学领域的一项突破性技术；AB SCIEX TripleTOF 5600+的高采集速度才使得这项技术得以实现。该技术为蛋白质组学研究带来了一种全新的工作流程。数据采集方法是将扫描范围划分为以25 Dalton为间隔的一些列区间，通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息，是MS/MSALL 技术的扩展。

　　SWATH方法完成一次循环仅仅需要三秒左右的时间，针对目前对蛋白质组学分析的纳升液相的一个色谱峰宽度来说，“这就像我们遥感卫星对地面形貌进行快速航拍分析一样，能在很短的时间内获得地貌形态的完整分析。”李博士形象比喻。

　　传统的MRM方法通常只是获得一些离散的数据点，用基于TripleTOF 5600的高分辨的MRM方式，可以对数据进行更准确的分析，但仍然不是样品的完整信息；最新推出的SWATH技术流程，通过快速的扫描速度加上对Triple TOF MS/MSALL 设置，得到完整的信息。

　　SWATH技术只能在 TripleTOF™ 5600 上完成，因为这需要将极高的采集速度与定量能力、精确质量及高分辨率整合在一起才能实现。在定性鉴定后进行全面的定量分析，不需要方法开发；获得所有化合物的信息，可以对所有化合物进行溯源；高分辨的定量分析减少潜在的干扰；定量能力达到了三重四极杆质谱的水平。

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