博纳艾杰尔推出奶粉中双氰胺的检测方法

　　原标题：奶粉中双氰胺的检测方法 (HPLC-UV和HPLC-MS/MS法)

　　北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。

　　本文采用天津博纳艾杰尔科技的Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管(货号：MS-DI5001)和Venusil® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。

　　

　　实验部分

　　仪器和试剂

　　高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。

　　双氰胺标准品，Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil^® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。

　　实验方法

　　提取、净化

　　称取1g试样于50ml具塞离心管中，加入2ml水溶解后，加乙腈定容至10ml，超声10min，8000r/min离心5min，取2ml上清液加Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管中，，涡旋0.5min，8000r/min离心5min，取上清液过0.22um滤膜，待测。

　　HPLC法：

　　色谱条件：

　　色谱柱：Venusil® HILIC 5μm 100Å 4.6*250mm;

　　流动相：A：10mmol/L乙酸铵(pH=4.0);

　　B：乙腈;

　　A：B=10:90;

　　检测波长：220nm;

　　进样量：10µl;

　　柱温：30℃;

　　流速：1ml/min。

　　实验结果：

　　线性关系和检出限

　　准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液;

　　分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为0.1µg/ml，0.5µg/ml，1.0µg/ml，2.0µg/ml，5.0µg/ml和 10.0µg/ml的标准溶液，按照上述色谱条件，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表2：

表2 双氰胺线性方程和定量限(HPLC法)检测方法稳定性考察

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	4.92min	Y=116.44X+3.2699	0.9997	0.1µg/ml

　　检测方法稳定性考察

　　选用10.0µg/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表3：

表3 检测方法定性和定量稳定性考察考察(HPLC法)准确度和精密度

标号	保留时间，min	峰面积
1	4.930	1061.7
2	4.933	1072.2
3	4.930	1064.4
4	4.929	1079.7
5	4.930	1067.3
6	4.934	1073.6
RSD，%	0.04	0.62

　　准确度和精密度

　　选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表4

表4 10µg/g添加回收实验结果(HPLC法)LC-MS/MS法：

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
98.6	88.4	89.8	92.3	5.99

　　LC-MS/MS法：

　　色谱条件：

　　色谱柱：Venusil® HILIC 5μm 100Å 2.1*150mm;

　　流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵(pH=4.0)

　　B：乙腈

　　A：B=10:90

　　进样量：10µl;

　　柱温：30℃;

　　流速：0.2 ml/min。

　　质谱条件

　　质谱仪：API 4000+;

　　离子源：电喷雾离子源;

　　扫描方式：正离子扫描;

　　检测方式：多反应监测;

　　CAD：8.00;

　　CUR：10.00;

　　GS1：60.00;

　　GS2：50.00;

　　IS：5500.00;

　　TEM：500.00。

表5 双氰胺质谱信息

药物名称	监测离子对	DP	EP	CE	CXP
双氰胺	85/68	71	10	41	6
	85/43	71	10	41	6

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。

　　实验结果

　　线性关系和检出限

　　准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液;

　　分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和500ng /ml的标准溶液，按照上述液质方法，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见下表6：

表6 双氰胺线性方程和定量限(LC-MS/MS法)检测方法稳定性考察

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	3.15min	Y=8777.2X+7435.9	0.9993	5ng/ml

　　选用50.0ng/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表7：

表7 检测方法定性和定量稳定性考察考察(LC-MS/MS法)

标号	保留时间，min	峰面积
1	3.29	382950
2	3.30	387950
3	3.25	382840
4	3.31	399820
5	3.30	378580
6	3.30	383810
RSD，%	0.65	1.92

　　准确度和精密度

　　选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表8。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

表8 100ng/g添加回收实验结果

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
84.6	80.7	90.2	85.2	5.61

双氰胺检测方法包订货信息

产品名称	规格型号	货号
MAS-QuChERS-双氰胺净化管	100mg/10ml，100支/包	MS-SQA01
Venusil HILIC	4.6*250mm，5μm，100Å	VH952505-0
2.1*150mm，5μm，100Å	VH951502-0
微孔滤膜	0.22μm，直径13mm,200/PK	AM021320
双氰胺对照品	1g/瓶，含量≥99.0%	DCD-0001
离心管	50mL，带螺纹盖，25个/包	L050025-C
一次性无菌注射器	5mL,100/pk	ZSQ-5ML

　　附图

　　

图1 定性定量稳定性考察谱图(HPLC法)

　　

图2 双氰胺0.5μg/ml标准溶液谱图(HPLC法)

　　

图3 奶粉空白谱图(HPLC法)

　　

图4 奶粉10μg/g空白谱图(HPLC法)

　　

图 5 10ng/ml双氰胺标准溶液质谱图

　　

图 6 奶粉空白质谱图