浮游植物定量及叶绿素a测定

2.4.2.1 浮游植物定量

个体计数仍是目前常用的浮游生物定量方法。计数浮游生物时，需使用计数框来限定待计数样品的体积或面积，计数框的长、宽、高 (深) 用测微尺或卡尺准确测量。常用计数框有0.1 mL 和1 mL 两种。计数前要将样品充分摇匀，然后用滴管在水样中部吸液移入计数框内。移入之前要将盖玻片斜盖在计数框上，样品按准确定量注入，在计数框中一边进样，另一边出气，这样可避免气泡产生，注满后把盖玻片移正。计数片子制成后，稍候几分钟，让浮游植物沉至框底，然后计数。不易下沉到框底的生物，则要另行计数，并加到总数之内。浮游植物计数时，吸取 0.1 mL 样品注入 0.1 mL 计数框，在 10 × 40 或8 × 40倍显微镜下计数，藻类计数 200 个视野，计数两片取其平均值。如两片计数结果个数相差 15%以上，则进行第三片计数，取其中个数相近的两片平均值。

藻类计数亦可用长条计数法，选取两相邻刻度从计数框的左边计数到计数框的右边成为一个长条。在长条计数法时，方格的底边和顶边分别为计数边和不计数边，统计移过中心垂线的浮游生物。与底边刻度相交的个体，应计数在内，与顶边相交的个体，不计入在内，与底边和顶边刻度都相交的个体，以生物体的中心位置作为判断的标准，也可以在低倍镜下，按上述原则单独计数，最后加入总数之中。计数时，首先旋转目镜的位置使中心线与计数框的一边重叠，再移动载物台，逐步计数。也可用直尺式目镜测微尺进行长条计数，即直尺相当于中心垂线，顶端刻度相当于顶边，底端刻度相当于底边。一般计数 3条，即第 2、5、8 条，若藻体数量太少，则应全片计数。硅藻细胞破壳不计数，硅藻细胞空壳可按中心纲和羽纹纲分别单独计数，但不加入总数之中，仅用于硅藻计数的校正。若计数种属的组成，分类计数200个藻体以上。用划“正”字的方法，则每划代表一个个体，记录每个种属的个体数。个体计数时，单细胞者一个细胞为一个体，定形群体者一群为一个体，不定形群体者按视野内的具体分散状态各定为一个体。本书研究采用长条计数法。

把计数所得结果按下式换算成每升水中浮游植物的数量:

煤矿塌陷塘环境生态学研究

式中:N为每升水中浮游植物的数量(ind/L);A为计数框面积;AC为计数面积(mm2)，即视野面积×视野数或长条长度×参与计数的长条宽度×镜检的长条数;VW为1L水样经沉淀浓缩后的样品体积(mL);V为计数框体积(mL);n为计数所得的浮游植物的个体数或细胞数。

2.4.2.2 叶绿素a测定

叶绿素是植物光合作用中的重要光合色素。通过测定浮游植物叶绿素a，可掌握水体的初级生产力情况。在环境监测中，可将叶绿素a含量作为湖泊富营养化指标之一。

(1)水样的采集与保存

可根据工作需要进行分层采样或混合采样。湖泊、水库采样500mL，池塘300mL，采样量视浮游植物量而定，若浮游植物数量较少，也可采样1000mL。采样点及采样时间同“浮游植物”。

水样采集后放在阴凉处，避免日光直射。并立即进行测定前的预处理，如需经过一段时间(4～48h)方可进行预处理，则将水样保存在低温(0～4℃)避光处。在每升水中加入1%碳酸镁悬浊液1mL，以防止酸化引起色素溶解。水样在冰冻情况下(-20℃)最长可以保存30d。

(2)仪器设备

进行叶绿素a的测定时，所需的仪器设备有:分光光度计、真空泵、离心机、乙酸纤维滤膜(孔径0.45um)、抽滤器、组织研磨器或其他细胞破碎器、碳酸镁粉末、90%丙酮。

(3)实验步骤

1)以离心或过滤浓缩水样，在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大(约为50kPa)。水样抽完后，继续抽1～2min，以减少滤膜上的水分。如需短期保存1～2d，可放入普通冰箱冷冻，如须长期保存(30d)，则放入低温冰箱(-20℃)保存。

2)取出带有浮游植物的滤膜，在冰箱内低温干燥6～8h后放入组织研磨器中，加入少量碳酸镁粉末及2～3mL的90%丙酮，充分研磨，提取叶绿素a。用离心机(3000～4000r/min)离心10min，将上清液倒入5mL或10mL容量瓶中。

3)再用2～3mL的90%的丙酮，继续研磨提取，离心10min，并将上清液再转入容量瓶中。重复1～2次，用90%的丙酮定容为5mL或10mL，摇匀。

4)将上清液在分光光度计上，用1cm光程的比色皿，分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。即以663nm、645nm、630nm波长的吸光度依次减去750nm的吸光度，作为这3个波长的真正吸光度。

(4)计算方法

叶绿素a的含量按如下公式计算:

叶绿素a(mg/L)=

煤矿塌陷塘环境生态学研究

式中:D为吸光度;V1为提取液定容后的体积(mL);V为水样体积(L);δ为比色皿光程(cm)。