菌落计数工具大比拼

　　要想确定样本里的细菌或病毒数，标准方法是进行系列稀释并涂布平板，然后对平板上的菌落或蚀斑进行计数。“蚀斑是展现病毒完成感染循环的重要途径，”哥伦比亚大学的病毒学家Vincent Racaniello说，他主要在动物细胞中研究脊髓灰质炎病毒和鼻病毒。

　　这项工作看起来简单，不过一旦样品多起来，难免会让人心生厌烦。如果每天需要对成百上千的平板进行计数，那手动方法显然并不现实。为此，人们开发出了带有高分辨率彩色相机和多种照明模式的自动化菌落计数仪，这些仪器甚至可以识别肉眼难以看到的微小菌落。除了菌落计数之外，这类仪器还具有多种功能，例如读取平板上的条码标签，对螺旋平板进行计数，以及测量抑菌圈等等。

　　The Scientist杂志对现有的一些菌落计数工具进行了比较分析，希望可以帮助研究者们做出最适合自己的选择。

　　手动计数

　　目前，大多数研究细菌或酵母的实验室，仍然选择对菌落进行手动计数，英国Synbiosis公司的销售经理Martin Smith说，这是一家专门生产自动化菌落计数仪的公司。

　　最基础的菌落计数其实就跟数数一样简单。为了避免重复计数，许多研究者一边计数一边用记号笔在平板上做记号。也有一些研究者使用手持式的简易计数器，并将平板放在照明盒上，让菌落更加清晰。

　　美国Cole-Parmer公司提供一种菌落计数笔，可以感应到在平板上做标记时的压力，在发出信号音的同时计数。不过，有些用户觉得这种计数笔的墨水干得太快。英国Bibby公司的SC6PLUS菌落计数器也是一款类似产品，它同样基于压力感应，并且带有一个平板支架和内置放大镜。此外，西班牙IUL公司也生产类似的菌落计数器。

　　通量：手动计数适用于平板不多的基础研究者。据估计，完成100个85mm平板(每板30–300个菌落)的计数，大约需要半天。Racaniello指出，对100个6孔板(每孔10-100个蚀斑)进行计数大概需要一到两个小时。

　　精确性：不同操作者的计数可能会存在一点差异，不过每板计数三次，可以保证结果的可靠性。

　　优点：经济、简便

　　缺点：单调繁琐、容易引入人为误差、有损健康

　　Tips：如果平板上的菌落超过两百，可以对其进行分区计数，然后估算出总数。这样能节省不少时间，但结果不会非常精确。另外，尽量由同一个人计数所有平板，以保证结果的一致性。

　　自动菌落计数仪

　　现在有不少科学家已经开始使用自动化的菌落计数仪，你可以选择简单的计数模块，也可以搭配复杂的分析软件。

　　基本款：Synbiosis公司的aCOLyte 3，是一款直观且便宜的入门级菌落计数仪。这款仪器能够识别直径小至0.3mm的菌落或蚀斑，并计算总数。此外，IUL公司的Flash & Go也提供基本的计数功能。这类系统并不带有特殊的额外功能，基本只是单纯的计数。

　　进阶款：高端一些的菌落计数仪，除了能对菌落和蚀斑进行计数以外，还具有许多其它功能。例如，Synbiosis公司的Protocol 3能够提供菌落或蚀斑的大小和形态数据，还可以利用内置软件对抑菌圈进行测量。ProtoCOL 3的可选模块还可以实现更多功能，包括对螺旋平板进行计数，Ames实验分析等等。Ames实验是通过测定组氨酸依赖型细菌的突变率，来鉴定致癌物的一种方法，突变可以使这些细菌获得在无组氨酸培养基上生长的能力。

　　据Smith介绍，ProtoCOL 3系统所带的相机，可以识别人类肉眼勉强可见的菌落(小至43微米)。当然，许多其他公司的类似计数仪也能够识别小于100微米的菌落。

　　IUL公司的Flash & Grow菌落计数仪也可以实现多种功能，该仪器的基础配置中含有区分颜色和大小的软件模块。如果选择抑菌圈测量模块，也可以将其用于抗生素药物的测试。

　　绝大多数自动菌落计数仪带有彩色相机，允许用户区分不同颜色的菌落。UVP公司的ColonyDoc-It菌落计数系统，还能够识别表达绿色荧光蛋白的菌落。ColonyDoc-It和ProtoCOL3都带有拉门，可以防止外部环境光线对平板产生影响，确保成像时的照明条件。

　　通量：自动菌落计数仪能够实现对成百上千平板的高通量计数，对于制药企业、水或食品安全实验室特别有用。据估计，手动计数一个平板平均可能需要73秒，而用Flash & Go等自动菌落计数系统只需要一两秒。为了实现高通量，IUL还提供有一款平板处理系统，能够自动装载八十块平板进行成像。

　　精确性：自动化系统的精确性很好，一些研究者更信赖自动化系统所提供的结果。

　　优点：快速、可避免人为因素造成的误差、内置多种分析功能

　　缺点：价格较高。此外，形态怪异或过于接近的菌落、霉菌、残渣、平板上的书写痕迹、培养基中的气泡都可能对计数准确性造成影响，需要用户进行校正。

　　Tips：拿到仪器后先进行验证，将仪器计数与之前的常用方法进行比较。保持平板底部清洁，在平板盖或侧面做标记。

　　另外，Bern 大学的Silvio Brugger设计了DIY菌落计数仪，并用它来研究肺炎球菌(PLOS ONE, 7:e33695, 2012)。如果难以承受高端计数仪的价格，又对计数功能有一定的需求，那么DIY也许可以成为一种另类的选择。