第一届全国样品制备学术报告会大会报告一

　　2013年8月4日，由中国仪器仪表学会分析仪器分会样品制备专业委员主办，中国科学院大连化学物理研究所协办的“第一届全国样品制备学术报告会”在美丽的大连举行。会议期间来自湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室的姚守拙院士、来自中国科学院大连化学物理研究所的张玉奎院士、来自中国科学院生态环境研究中心的江桂斌院士、来自农业部农产品质量安全重点实验室的王静教授、来自北京大学化学与分子工程学院的刘虎威教授等多名专家学者在样品制备方面做了精彩的报告。

会议现场

湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室 姚守拙院士

　　来自湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室的姚守拙院士带来了《微纳尺度样品制备与新型功能材料的构筑及其应用》的报告。

　　新挑战和新机遇

　　姚院士在样品制备技术的新挑战和新机遇中表示“样品不经任何前处理而直接进样几乎是不可能的”，样品前处理步骤通常包括采样、匀浆、萃取、净化、浓缩和衍生等。姚院士说：“最好的样品前处理就是不做任何处理，但是实际中为了除去基质干扰、发现目标分析物、浓缩低含量组分、释放结合残留物并改善分离或检测性，不得不进行样品前处理。”

　　样品前处理现代分析的瓶颈主要有分析过程的时间消耗和分析过程的误差来源两个方面。新型功能材料是样品前处理的一个新的突破口，包括具有特殊表面性质、优良吸附性能、可控组装和选择性修饰的纳米粒子。根据功能材料的介质类型、构筑尺度和应用特点，这些新技术可概括为以下三种主要形式：基于纳米复合材料的高选择性固相萃取、基于表面功能化磁性微球的固相微萃取和基于硅胶杂化整体材料的在线分离与富集。

　　基于纳米复合材料的高选择性固相萃取

　　在多壁碳纳米管-分子印迹聚合物(MWNTs@MIPs)的介绍中，姚院士主要列举了MWNTs@MIPs在线固相萃取中辣椒中的苏丹红IV、鸡肉中的红霉素和药材中齐墩果酸的前处理应用；并介绍了碳纳米管-离子印迹聚合物固相萃取飞尘中的Ga³⁺；复合磁性Fe₃O₄@SiO₂@IIPs萃取环境水体中的Pb²⁺；离子液体修饰磁纳米粒子在胶束固相萃取水中多环芳烃中的应用；钛纳米管混合涂层纤维微萃取水体和土壤中的多环芳烃、河水中的全氟辛酸；胆固醇改性核壳磁纳米粒固相萃取中药材中的多环芳烃。

　　基于表面功能化磁性微球的固相微萃取

　　在表面功能化磁性微球的固相微萃取技术中，姚院士主要介绍了炭材包裹磁性微球(Fe₃O₄@C)微波辅助萃取植物叶中的多环芳烃；三苯胺修饰复合微球(Fe₃O₄@SiO₂@TPA)固相萃取水样中的多环芳烃；C18-功能化磁性微球(Fe₃O₄@C18)超声辅助萃取土壤中的多环芳烃；离子液体-复合磁性功能材料(Fe₃O₄@SiO₂@ILs)固相萃取水中的氯酚等应用。

　　新型硅胶杂化整体柱用于在线分离与富集

　　姚院士表示与传统填充柱相比，毛细管整体柱作为新型的色谱分离介质(固定相)，具有制备简单、通透性好、传质阻力小、比表面积大、柱载量高、孔结构可调等优点。新型有机-硅胶杂化整体柱兼顾有机聚合物整体材料和无机硅胶整体柱的优点。新型硅胶杂化整体柱的应用主要包括基于L-Phe分子印迹杂化硅胶的新型HPLC手性固定相；采用溶胶凝胶法，通过四甲氧基硅烷(TMOS)和氯丙基三甲氧基硅烷(CPTMS)缩合制备硅胶整体柱并进行疏水表面修饰；以TMOS和乙烯基三甲氧硅烷(VTMS)合成表面带有烯基的杂化整体柱，再利用巯-烯点击反应原位键合十八烷基和氨基构建修饰可控的有机-硅胶杂化整体柱。

　　样品制备中的新型功能材料：构筑尺度与基本用途

　　最后姚院士归纳到样品制备中的新型功能材料包括纳米结构、功能微球和整体柱，可作为吸附剂、支撑载体、分离介质和辅助离子化基体使用。

中国科学院大连化学物理研究所、中科院分离分析化学重点实验室 张玉奎院士

　　来自中国科学院大连化学物理研究所、中科院分离分析化学重点实验室的张玉奎院士带来了《蛋白质组样品预处理新技术》的报告。

　　张院士表示人类蛋白质库中2万个编码蛋白的基因所对应的代表性蛋白中，有近8000个低拷贝数的蛋白仍然没有被发现。其中这些未发现的蛋白中，没有证据和弱证据的蛋白在哪些细胞通路中?有什么功能?疾病分子标志物和药靶是否在8000个没有被发现的蛋白中?是不是有的蛋白从来不要也不会被人类基因表达?张院士表示科学需要发展高效分离、高灵敏度鉴测技术与装置。

　　通用性样品预处理技术

　　基于噬菌体展示文库的蛋白质均衡技术

　　对于人血清样品预处理方法，张院士提出了基于噬菌体展示文库的蛋白质均衡技术，M13噬菌体单链可变区片段展示文库修饰于磁性颗粒表白，并介绍了ScFv@M13颗粒处理血浆样品流程，SDS-PAGE分析使白蛋白质丰度显著降低、各组分中出现新蛋白质条带。结果表明基于噬菌体展示文库的蛋白质均衡技术能够有效去除高丰度蛋白质。

　　选择性样品预处理技术

　　基于分子印迹的高丰度蛋白质去除技术

　　抗体中，高丰度蛋白去除和低丰度蛋白的富集重现性差、使用条件苛刻、价格昂贵、很多重要抗体无法得到。以转铁蛋白的抗原决定基为模板，利用聚醚砜的自组装成球，并在制备过程中引入磁性纳米粒子，制备抗原决定基印迹多孔材料，作为人工抗体材料，用于选择性富集/去除目标蛋白。在聚醚砜的皮层下出现特有的指状孔结构和放射状大孔结构。

　　磷酸化肽段选择性富集技术

　　以参与蛋白磷酸化过程的磷酸腺苷为配基，通过提高配基的亲水性提高其对磷酸肽的选择性，并使材料制备过程简单易操作。同时，张院士还介绍了以三磷酸腺苷(ATP)为配基的磁性纳米材料；α-和β-酪蛋白混合物酶解产物中磷酸化肽的选择性富集；小鼠肝癌腹水瘤淋巴道高低转移细胞株的差异磷酸化蛋白质组定量研究

　　糖基化肽段选择性富集技术

　　目前糖肽富集策略中亲水作用色谱法(HILIC)无歧视效应、不破坏糖链结构、操作条件温和、易于在线联用。张院士还介绍到了GMA-PEGDA@SH@Au@Cys用于lgG酶解产物中糖肽的富集；糖肽在线富集-去糖基化策略；人血清样品中糖蛋白分析等先进技术。

　　N-糖蛋白质组相对定量标记

　　张院士表示在定量过程中确保准确性及N-糖基化位点归属至关重要。二甲基化和固相18O串联同位素标记策略克服了传统¹⁸O标记局限，增强N-糖基化位点定性及定量的准确性；PNGase F IMER固相¹⁸O标记效率评价表明标记效率与自由溶液标记相当，标记时间只用1.8min，提高了分析通量。在小鼠肝癌腹水瘤淋巴道高低转移细胞株N-糖基化蛋白质组定量分析中，4个糖肽的糖基化位点占有率发生了变化，5个糖蛋白质下调，2个糖蛋白质上调。

农业部农产品质量安全重点实验室 王静教授

　　来自农业部农产品质量安全重点实验室的王静教授带来了《基于新型材料的快速检测技术研究及其进展》的报告。

　　农产品安全快速样品前处理技术

　　王教授介绍了4种快速前处理技术的优缺点及一些应用：分散固相萃取技术的QuECHERS方法，此方法具有简单、快速和成本低等特点，应用于水果蔬菜中229种农药的QuECHERS快速前处理方法；液相微萃取技术的分散液液微萃取技术具有有机溶剂用量少和富集浓缩倍数高的特点，此方法可与QuECHERS方法相结合，建立果蔬及粮谷中24种农药的GC-ECD检测方法；亚临界水萃取技术具有绿色环保、较低极性和可代替甲醇的特点，可应用于测定土壤、蔬菜、小麦中的农药等；分子印迹固相萃取的分子印迹特异性识别具有高选择性、高特异性和重复使用等特点，可应用于三嗪类农药、磺酰脲类农药、β-受体激动剂等的“类特异性”分子印迹前处理技术和产品研发，和氯霉素、三聚氰胺、壬基酚等特异性分子印迹前处理技术和产品研发。

　　农产品安全快速检测技术

　　在快速检测技术研究中，王教授介绍到了磁性纳米粒子免疫分析技术，磁性纳米粒子可包被生物高分子的核壳结构，具良好的磁导向性和生物相融性，可与蛋白质、核酸、生物素等结合；磁性分子印迹分析技术是磁性纳米粒子与分子印迹聚合物的结合形成，是一种富集能力强和特异性识别的功能性高分子识别材料；荧光标记-磁性分子印迹分析技术能够应用于竞争法荧光检测阿特拉津，荧光光谱显示三嗪类农药分子浓度在0.5-32ppm时，以336nm为激发波长时，发射波长在421.91nm外荧光强度有明显差异，且这种差异成线性关系；化学发光免疫分析技术是将化学发光分析和免疫反应结合，兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性；生物条形码免疫分析技术中，目前设计并合成了4条具不同功能DNA链，包括烷基硫醇修饰的条形码DNA捕捉链、生物条形码DNA链、固定于芯片上的氨基化捕捉探针DNA链和检测探针DNA链；基于分子印迹敏感芯片的SPR传感器是以合成磺酰脲类农药分子印迹膜研制分子印迹敏感芯片，建立以分子印迹膜为敏感材料的高通量SPR传感器检测技术。

　　近5年科研成绩

　　最后，王教授介绍了近5年来的科研成绩：“基于分子印迹技术的高效识别样品前处理技术及应用”获2012年北京市科学技术奖；“分子识别及高通量样品前处理技术及应用”获2012年中国分析测试协会科学技术奖。同时，很多研究也得到了很多科研项目的资助。

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北京大学化学与分子工程学院 刘虎威教授

　　来自北京大学化学与分子工程学院的刘虎威教授带来了《SnO₂-ZnSn(OH)₆双金属纳米材料用作磷酸化多肽的选择性提取和富集》的报告。

　　刘教授表示生物药物的分离与检测中基质复杂，新型纳米材料衍生化新方法是一种选择性、高效样品处理方法。

　　报告中，刘教授介绍了样品处理方面的前期工作，包括蛋白质在线酶解、除盐、净化、富集集成装置；基于阳离子交换膜的新型酶解反应器；果汁中多种植物激素的SD-LLL提取和快速检测方法；基于双极膜电渗析的新型三氟乙酸去除装置；植物多肽激素的IAC富集和高灵敏度检测。

　　在研究背景中，刘教授介绍了金属氧化物亲和色谱的原理和问题：组成/合成/外貌不同的金属氧化物富集行为存在差异；新型双金属氧化物亲和材料富集报道极少且行为未知；绝大多数情况下MOAC对多磷酸化肽检测灵敏度不高。

　　标准蛋白酶解液的富集可以分为两步顺序富集：降低样品复杂度，增强多磷酸化肽检测。富集行为的差异性和多磷酸化肽选择性在ZnSn(OH)₆和SnO₂两步顺序富集和双组份SnO₂-ZnSn(OH)₆单次富集中，增强多磷酸化肽的检测、提高磷酸化位点检出率。

　　最后，刘教授提出了未来的工作还需要“瞻前顾后”、“兼及左右”和“浅入深出”。

武汉大学化学系、生物医学分析化学教育部重点实验室 冯钰锜教授

　　来自武汉大学化学系、生物医学分析化学教育部重点实验室的冯钰锜教授带来了《静电纺丝纤维材料的制备及其在多肽吸附中的应用》的报告。

　　冯教授首先介绍了课题组样品制备技术研究的内容，包括基于整体柱的固相微萃取技术、磁固相萃取介质制备方法和质谱衍生化试剂等。

　　在静电纺丝纤维材料的制备及其在多肽吸附中的应用中，冯教授主要介绍了静电纺丝的背景、有序介孔硅胶纤维和SiO₂/TiO₂杂化纤维等。

　　静电纺丝的背景

　　静电纺丝(electrospinning)首先出现在1745年，Bose利用高压将液滴转变成气溶胶，到了20世纪90年代，由于纳米材料的兴起，电纺纳米纤维开始得到重视。与电纺相关的论文也在2001年后开始逐年增长。现有的电纺材料包括PVA、PVP、PANi、PLA、PMMA；纤维素、明胶、壳聚糖；CTNs/PAN、TiO₂/PVP、SiO₂/PVA等。冯教授还介绍到了取向纳米纤维、中空纳米纤维和纳米结构的纳米纤维。静电纺丝可应用于传感器、电极、过滤和分离、催化等领域，在样品制备技术中，它容易制备纳米纤维，是一种通用的方法，纤维具有较大比表面积和较大孔体积，其形貌可控，易于进行电纺前后的修饰，具有良好的通透性。

　　有序介孔硅胶纤维

　　电纺制备有序介孔硅胶纤维用于快速富集血浆中多肽，富集过程只需3分钟，对比未处理、Zip-Tip C18除盐和OMSF富集三种方法的血浆MALDI-TOF质谱图，使用OMSF富集的质谱图基质干扰更少。

　　SiO₂/TiO₂杂化纤维

　　电纺制备SiO₂/TiO₂复合物纤维可用于磷酸化多肽的快速富集。在方法的可行性考察中，考察纤维对磷酸化多肽的选择性，β-casein和BSA酶解液混合液中磷酸化多肽的富集，表现出较高的选择性。在方法灵敏度的考察中，方法检出限为10fmol，表明该方法的灵敏度较好。

　　最后，冯教授总结电纺技术制备了有序介孔硅胶纤维和TiO₂ -SiO₂复合物纤维；建立了一种基于电纺纤维的注射器型微萃取装置；血浆中多肽、磷酸多肽的快速富集；电纺纤维在样品制备领域具有应用前景。

中粮营养健康研究院 杨永坛研究员

　　来自中粮营养健康研究院的杨永坛研究员带来了《QuEChERS方法在相关食品安全检测技术中的应用》的报告。报告中，杨老师主要介绍了农药残留分析中用到的样品前处理技术介绍、QuEChERS方法在茶叶农残分析中的应用和QuEChERS方法在葡萄酒农残分析中的应用等。

　　杨老师用两张统计图对比了一个典型色谱分析中的误差来源和时间消耗，结果体现了样品前处理的重要性。

　　农药残留分析中用到的样品前处理技术介绍

　　杨老师介绍到农药残留分析中用到的样品前处理技术需要用到提取、净化、浓缩、仪器检测和数据处理等步骤。提取方式包括索式提取、匀浆或均质法、振荡法、超声波辅助提取、加压溶剂萃取和超临界萃取等；净化方法包括液液分配、磺化法、固相萃取法、凝胶渗透色谱法和固相微萃取等。其中分散式固相萃取——QuEChERS具有快速、简单、便宜、有效、耐用和安全等特点，是2003年美国农业部率先提出，美国FDA和欧盟共同参与开发的一种样品前处理方法，QuEChERS是经过认证的官方方法。

　　QuEChERS方法在茶叶农残分析中的应用

　　杨老师介绍了茶叶中11种有机磷类农药残留的检测-处理条件选择。在提取剂的选择上，乙酸乙酯-正己烷(V:V=1:1)对基质中的杂质提取较少，对后续的净化较为有利；在提取方式的选择上，杨老师建议手摇之后超声辅助提取10min；在吸附剂用量的选择上，GCB能够去除色素和固醇类杂质，PSA能够去除有机酸、糖及其它基质。杨老师表示，应用QuEChERS-GC-FPD，建立了绿茶中11种不同极性有机磷类农药残留的快速分析方法，本方法简便快速，准确性好，2小时内可处理6-10个样品，处理成本小于10元/样品。

　　葡萄酒农残分析中的应用

　　葡萄酒多农药残留方法，前处理方法基于QuEChERS技术，便于工厂的检测人员开展实验，快速、准确、低成本和高效。在PSA和GCB填料量优化中，PSA用量对农药加标回收率没有太大影响，但葡萄酒含糖和含酸量较大，需加大PSA量，去除糖酸；GCB可吸附色素，但同时对嘧霉胺、蝇毒磷、百菌清、氟环唑和咪酰胺吸附较为严重，故采用50mg为GCB用量。在0.02-0.05mg/kg的添加浓度，平行实验5次，考察方法的重现性和回收率，49种农药的回收率在70%-125%之间；RSD<10%。

安捷伦科技(中国)有限公司的消耗品应用工程师 吴翠玲女士

　　来自安捷伦科技(中国)有限公司的消耗品应用工程师吴翠玲女士带来了《安捷伦固相萃取技术在真菌毒素分析中的应用》的报告。

　　吴老师主要介绍了Bond Elut系列等多种应用实例，包括Bond Elut Plexa萃取牛奶和奶粉中的黄曲霉毒素；QuEChERS基质分析固相萃取应用实例——面粉，花生等中的黄曲霉毒素；强阴离子交换应用实例——饲料和谷物中伏马菌素固相萃取方法-SN-T1572-2005、各种基质中的赭曲霉毒素A分析；葡萄酒中赭曲霉毒素A分析-固相萃取净化过程；GB/T 25220——2010粮食中赭曲霉毒素测定HPLC-FLR；Bond Elut Mycotoxin用于食品中12种真菌毒素分析；Nivalenol雪腐镰刀菌烯醇分析。

　　最后，吴老师总结到SPE柱与传统毒素净化柱相比，在净化性能上等同或者性能更佳，而且价格便宜；SPE柱的选择通常不是一一对应的关系，可以用一种SPE净化柱同时处理多种真菌毒素。

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