基因捕获技术:创建人类单倍体细胞库

　　日前，使用名为“基因捕获”(gene trap)的技术，奥地利的研究人员建立了一个人类单倍体细胞库，这个细胞库汇集了3000 多种细胞系，每个细胞系都具有一种不同的突变基因。相关的研究论文发表在8月25日的Nature Methods杂志上。渥太华大学教授William Stanford说：“我认为这是一个相当有趣的资源，我想人们会支持它。它的作用看起来非常强大。”

　　利用这些单倍体细胞系可以极大地促进基因功能研究。由于这些细胞中只含有一组染色体，其它染色体上等位基因突变的影响可以被屏蔽。斯坦福大学教授Jan Carette说：“相比于其他的技术，完全的基因敲除(complete knockout)可以获得更强大的表型。”人体细胞是二倍体，单倍体细胞系无法直接获得，因此奥地利科学院分子医学(CEMM)研究中心的 Sebastian Nijman和他的同事转而对KBM7人体细胞系进行研究。

　　KBM7 来源于一名慢性粒细胞白血病患者，除8号染色体外其余染色体全部都单倍化。虽然这些细胞是单倍体，它们仍然能够执行基本功能维持活力。“有些人认为，单倍体细胞是一些反常的细胞，但实际上，在细胞水平，单倍体与生命非常相容，”斯坦福大学教授Jan Carette表示。要构建每一种突变，研究人员用偏好于整合到活性转录的基因中的反转录病毒来感染细胞。Nijman认为“最终的结果是该基因几乎完全被沉默，类似于进行了基因敲除” 。

　　每个突变株都包含一个 GFP 标记和一个独特的遗传条形码，这样可以便于该突变株从克隆混合物中被识别。这些克隆另一个优点是它们的突变是可逆的。“基因捕获”载体的两侧是 loxP 序列。为这些细胞提供Cre重组酶，对loxP 进行切除，研究人员就可以去除被捕获的基因，并恢复正常的蛋白质翻译。

　　为了验证他们的细胞库，Nijman和他的同事们对他们创造的几个克隆的特征进行了特征鉴定。例如，位于JAK-STAT信号转导通路的一个JAK2 基因捕获的克隆，通常显示 STAT1 磷酸化水平降低。“虽然在意料之中，这是第一次利用完全失活的 JAK2 基因在人类细胞中证实这一点，” Nijman表示。

　　研究人员表示，从理论上讲，这样一个完整的覆盖了所有包括编码或非编码基因的细胞库，为系统地研究几乎所有细胞过程，如细胞周期控制、代谢、耐药或药物敏感等所需的基因功能及作用提供了一个很好的平台。到目前为止，该研究小组已经累计构建出了几千个人类基因组突变体，这些突变体可以通过Haplogen 和 CeMM 合作得到。

　　分子健康科学研究所的Anton Wutz认为临床研究人员将会尤其对这些克隆感兴趣。细胞生物学家可以产生自己的突变细胞株，而临床实验条件缺乏、想要检测患者突变的临床医生可以通过索取得到这些克隆进行检测，以确定他们所看到的是真正的病因还是与疾病不相关的现象。

　　这些克隆也存在一些局限。特别是KBM7 细胞并不能表达所有的基因。将这种方法扩展到来源于不同器官的单倍体细胞，尤其是单倍体胚胎干细胞，将大大增加实用性。Nijman补充说他们的研究小组还在继续扩大这一细胞库，但由于所整合的载体是随机的，产生新的细胞突变将越来越困难。如果结合其他方法，例如转录激活因子样效应物(transcription activator-like effectors ，TALE)和RNA 引导性核酸酶( RNA-guided nucleases，RGNs)，基因捕获技术或许可以帮助研究人员扩展细胞库。

　　Nijman的细胞库汇集了越来越多的技术，研究人员可以用它来更深入地了解人类基因组。制造人类基因组突变池，绝对是一件有前途的事情。

　　基因捕获技术简介

　　基因捕获技术是目前最具应用前景的基因克隆方法之一。利用该技术建立的随机插入突变的突变体文库，可用于寻找、鉴定和研究大量未知功能和已知功能的活化基因，它是继自然突变、物理突变和化学突变之后发展起来的新的分子生物学方法。

　　基因捕获的方法酷似以报告基因为诱饵来捕获基因。其基本过程是将一含报告基因的DNA 载体随机插入基因组,从而产生内源基因失活突变,并通过报告基因的表达激活提示插入突变的存在,及突变内源基因表达特点。通过筛选得到的插入突变的ES 细胞克隆经囊胚注射转化为基因突变动物模型,进而分析表型来研究突变基因功能。每一种ES 细胞克隆中含有不同的突变基因,在短期内可建立大量含不同基因突变的ES 细胞克隆库。突变基因的序列可通过基于PCR 的一些方法鉴定,同时还可能发现一些在体内表达或不表达的新基因。

　　基因捕获技术主要包括三种类型：

　　1.增强子捕获载体

　　含有一个最小的启动子和翻译起始位点,当载体整合到顺式增强子元件附近时,此增强子将调控报告基因的表达 。对报告基因在体内表达的ES 细胞系插入位点进行克隆鉴定发现插入位置邻近编码序列。关于增强子捕获的诱变比率还未见报道,但插入的性质预示由增强子捕获产生功能失活的突变比率较低, 因此,增强子捕获载体在小鼠体系中未得到广泛应用。

　　2.启动子捕获载体

　　通常由不含启动子成分的报告基因和一筛选标记基因组成,只有当载体插入到内源基因编码区序列中产生融合转录本时报告基因才可能表达 。因而启动子捕获的致突变比率很高。然而载体插入到外显子的频率非常低,捕获效率较增强子捕获至少低200倍。故载体中通常含有一个筛选标记基因,如新霉素抗性基因( neo) 或β-半乳糖苷酶(galactosidase) 与neo 的融合基因(β-GEO) ,保证载体插入的细胞克隆被筛选保留。由于插入发生在DNA 转录区,克隆插入位点就可确定突变基因。

　　3.基因捕获载体

　　中在无启动子序列的报告基因上游和下游分别含有剪接受体( splice acceptor ,SA) 和多聚腺苷酸加尾序列(polyA) ,当含有顺式作用的启动子和增强子元件被捕获基因转录激活时,载体中SA 与内源基因剪接供体( splice donor ,SD) 作用产生上游内源基因编码序列与报告基因融合转录本,使内源基因发生突变,同时报告基因的表达提示内源基因的表达特点。融合转录产物可作为克隆突变基因序列的模板。由于插入发生在内含子中,基因捕获的效率较启动子捕获至少提高50 倍。然而选择性剪接(alternative splicing) 的发生会导致低水平的野生型转录本产生而形成减效等位基因突变 。