从胚胎的角度研究肿瘤发生问题

　　一直以来，科学家们在研究某个基因的功能时无非就只有两种方法，要么就是敲除这个基因，或者下调其表达量，要么就是提高其表达量。在20世纪90年代发现的RNA干扰技术又给科学家们提供了一条新的研究基因功能的途径，RNA干扰技术可以通过小RNA分子(small RNA molecule)与目标mRNA结合，并使其降解的方式，特异性地抑制某个基因的表达。可是到目前为止，科学家们也只是利用RNAi技术对体外培养的细胞进行过全基因组筛查研究，这种细胞层面的研究方法不能涉及生理状态下细胞之间复杂的相互作用，可我们都知道，这些相互作用对于正常的组织行为，或者癌变等异常的病理改变才都是最重要的。在本期《自然》(Nature)杂志的第185页上，Beronja等人将向我们介绍全世界首次用RNAi技术进行的活体(小鼠胚胎)全基因组筛查研究工作，他们的目标是找出与非黑素瘤皮肤癌(non-melanoma skin cancer)形成有关的基因。

　　非黑素瘤皮肤癌是最常见的肿瘤之一，是由皮肤外层的表皮细胞(epidermal cell)恶变而发生的一种疾病。在胚胎发育过程中，当进行到孕中期(mid-gestation)时，外胚层(ectoderm)的表面会逐渐发育成表皮，并慢慢成熟成为一种不通透的皮肤保护屏障，同时也会发育出毛囊(hair follicle)等皮肤附属结构。早期的非黑素瘤皮肤癌研究发现，Ras基因家族(Ras gene family)成员是非黑素瘤皮肤癌致病基因，但是由于技术的限制，不能在单细胞水平对Ras基因的活性进行研究，所以无法了解其它基因在非黑素瘤皮肤癌，以及其它肿瘤发病过程中起到的致病作用。

　　Beronja等人之前已经发现了一种可以在发育表皮中进行RNAi操作的方法。他们的方法就是借助慢病毒载体(lentiviral vector)在小鼠胚胎外胚层表层细胞里表达shRNA(这种RNA在细胞内表达之后会进一步被切割成RNAi分子)。现在他们已经将这项技术发展到可以对表皮细胞的全基因组(外显子组)进行筛查，这主要归功于他们有了一个针对小鼠细胞当中每一mRNA的shRNA文库。由于发育中的表皮细胞是以一种非常“保守的(reproducible manner)”方式进行分裂增殖的，所以任何RNAi序列，只要它们能够改变表皮细胞正常的增殖速度，那么就可以通过确定整个RNAi库中这种RNAi 序列数量(增加或者减少)的方法发现它们。所以Beronja等人进行了这种研究，他们对RNAi操作开始时和RNAi干扰9.5天之后的小鼠胚胎进行了比较，主要比较了细胞中shRNA的丰度，结果就发现了被抑制之后能够促进细胞增殖，或者抑制细胞增殖的基因。

　　Beronja等人进行了两次筛查，分别寻找了与细胞正常发育有关，以及与细胞癌变(通过诱导Hras1基因表达的方法促使细胞癌变)有关的基因。在这两次筛查当中都发现了同一种基因，那就是β连环蛋白(β-catenin)编码基因，但是该基因对这两种情况下的细胞增殖却起到了截然相反的作用。之前的研究也发现，β连环蛋白与非黑素瘤皮肤癌的发生有关，也发现如果表皮细胞不表达这种蛋白，也能够促使细胞增殖(hyperproliferation)，Beronja等人的发现也符合前人的这些研究成果。

β连环蛋白是粘着连接(adherens junctions)的重要组成部分，所谓粘着连接是一个蛋白复合体，位于上皮组织细胞和内皮组织细胞之间，所以β连环蛋白在细胞之间的粘附作用当中扮演了非常重要的角色。与此同时，β连环蛋白还是Lef1/Tcf转录因子家族成员一个非常重要的辅因子(cofactor)，而Lef1/Tcf转录因子家族成员则正是Wnt信号通路的效应因子。由此可见，β连环蛋白对于多个非常重要的细胞基础进程都起到了调控作用。如图1所示，Beronja等人在筛查研究工作中发现，β连环蛋白对正常表皮细胞的生长起到了负向调控的作用。之后的体外试验又发现这个负向调控作用是不依赖于Wnt信号通路的，而是与细胞之间的接触抑制作用相关。可是在对表达了Hras基因的小鼠胚胎表皮细胞的筛查工作中却发现β连环蛋白对这种细胞的生长起到了正向调控的促进作用，这种作用却又与Wnt信号通路活性上调相关。可之前有一项研究发现，在表皮细胞中表达抑制型的(inhibitory form)Lef1，阻断Wnt信号通路之后对肿瘤的形成造不成明显的影响。因此，我们还需要开展更多的研究，深入了解β连环蛋白以及Wnt信号通路对肿瘤的影响作用和意义。

　　β连环蛋白与正常细胞和癌变细胞的关系。Beronja等人对正常的小鼠胚胎表皮细胞，和表达了Hras基因的小鼠胚胎表皮细胞进行了全基因组RNAi研究，发现β连环蛋白对于维持表达了Hras基因的小鼠胚胎表皮细胞异常活跃的增殖非常重要，但他们同时也发现，抑制β连环蛋白的表达就能够抑制细胞增殖。Beronja等人认为，这种作用可能与β连环蛋白在Wnt信号通路中的作用有关。可是对正常细胞的筛查却发现抑制β连环蛋白的表达却能够促进正常表皮细胞的增殖。之后的试验发现，这种作用与β连环蛋白在维持表皮细胞之间的粘着连接复合体(adherens-junction protein complexes)方面的作用有关，如果破坏了这种连接复合体，就会影响控制正常细胞生长的接触抑制机制(contact-inhibition)

　　之前已经有人发现β连环蛋白与多种恶性肿瘤疾病相关，但是Beronja等人这一次在表达了Hras1蛋白的异常增殖细胞当中还筛到了另外一个基因，那就是 Mllt6基因。之前有人发现，Mllt6基因的染色体转位(Chromosomal translocation)异常与混合型髓性白血病(mixed myeloid leukaemia)的发生有关。虽然Mllt6蛋白的确切功能现在还不清楚，但是我们已经知道，该蛋白与Dot1a组蛋白甲基转移复合体(Dot1a– histone methyltransferase protein complex)在胞内的亚细胞定位有关，也能够对几个特定的基因网络(gene network)起到调控作用。与β连环蛋白一样，Mllt6蛋白也是因为Ras基因突变而恶变的肿瘤细胞增殖所必需的因子之一。在Mllt6基因的启动子上有多个Lef1/Tcf转录因子的结合位点，这说明β连环蛋白可以通过Wnt信号通路对Mllt6基因的表达起到调控作用，即Mllt6基因是β连环蛋白的下游靶标因子。不过我们还需要进行更进一步的研究，以确定β连环蛋白是否直接调控了Mllt6基因?是否这两个因子就足以促使细胞过度增殖?或者 Mllt6蛋白是否通过其它信号途径发挥了促癌作用?这些问题都是非常重要的问题，因为这决定了开发靶向药物所需要确定的作用靶点问题。

　　Beronja 等人开展的这项崭新的全面式研究给我们提供了大量的信息。他们研究获得的大量信息为我们将来开展全面的计算机数据分析打下了坚实的物质基础。他们发现的某些基因可能还与表皮附属器(epidermal appendage)的形成有关，而不仅仅是与细胞的增殖有关。以这一段胚胎发育时期的基因表达谱(gene-expression pattern)数据为基础，对Beronja等人获得的这些数据进行筛选也能够有重要的发现，有助于建起里一个基因分类框架，看看哪些基因与内环境稳态(homeostasis)相关，哪些基因与发育相关，哪些基因又是能够促进细胞生长的癌基因。除此之外，这些与Ras所诱导的细胞增殖作用相关的基因是所有细胞异常增殖的作用基础吗?不同的组织是否进化出各自不同的内环境稳态控制机制呢?这些都是非常值得研究的问题。