Biotechniques：新一代测序中的缺口填补

　　在完成的基因组的复兴时代，科学家使用由第三代测序技术提供的长读取，来填补基因组装配中的缺口（gap）。新一代测序能赶得上吗？

　　新一代测序，可让科学家们以比Sanger测序更快的速度和更低的价格，进行基因组测序，为1000美元基因组测序铺平了道路。但是这种方法牺牲了长读取速度，将平均读长减少至大约100个碱基对，而不是Sanger测序的800-900个碱基对。短的读取长度使得基因组装配更加困难，因为要产生可比较的装配，就需要增加覆盖范围，即，更多的重叠序列读长。

　　但是更深的覆盖范围并不能弥补某些问题。对于从头装配（de novo assembly）来说，比读取长度更长的重复序列会产生缺口，从而造成近年来比以往更多的分散组装。因此，更难检测到重复区域中的变异，这对于理解某些疾病可能是很重要的。

　　贝勒医学院人类基因组测序中心的遗传学家Kim Worley称：“关于短的读取数据，令人沮丧的是，在100个碱基对的读长内没有大量的信息含量。”她指出，目前的恒河猴（一种重要的医学动物模型）基因组草图，包含其基因模型高达20%的序列缺口。

　　她说：“我们已经完成了人类基因组和小鼠基因组测序。但是即使这些完成的基因组，也有不完全连续和正确的区域，这些数据的用户总是不满意这些区域。”

　　为了解决这个问题，Worley及其同事借助于Pacific Biosciences (PacBio) RS平台，第三代测序技术，可以进行实时单分子测序反应。该系统产生的平均读取可跨度几千个碱基，在某些情况下，最大读取长度可达到30,000个碱基。

　　这些长的序列读长，可简化基因组装配，因为它们可以跨越重复区域，并且，因为不需要源DNA的扩增，某些测序假象（artifacts）和基因组覆盖偏差也有所减少。因为PacBio RS平台产生长的读取，而没有GC偏差或系统误差，它是唯一适合于升级基因组装配的技术。

　　先前在《PLoS ONE》的一篇报道中，Worley和她的同事们开发了一种自动化的软件工具，称为PBJelly，它可将长的PacBio读取排列成装配草图，以关闭或改善缺口，同时保留注释。通过将这种方法应用于四种基因组――一种模拟的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）基因组、拟暗果蝇（Drosophila pseudoobscura）的版本2草图、Assemblathon 2.0虎皮鹦鹉数据库的装配、乌黑白眉猴基因组的初步装配、研究人员解决了63%到99%的缺口，并能关闭32%到69%，提高12%到63%。

　　PacBio首席科学官Jonas Korlach说：“我们正在经历一个完成基因组的复兴时代。回到Sanger测序年代这是真正的规范，但是当新一代测序到来时，它几乎被抛弃了，因为用Sange测序来关闭这些基因组不可能，或者说很难处理。”

　　追赶

　　原则上，PBJelly可以应用于任何平台产生的长序列读取。在新一代测序公司赶上PacBio的读取长度时，这种特征在未来可能是很重要的。

　　在这个方向的一个举措是，Illumina对San Francisco-based startup Moleculo的收购。Moleculo开发的技术，允许我们在标准的新一代测序Illumina系统上对大的DNA片段进行测序，随后装配成合成长读取。来自每个分子的短序列读取被分别装配，最终的结果是所有片段的一个完整序列。基本上，短的读取数据被重建成长的读取。

　　在国际植物和动物基因组会议上，一组科学家报道称，Moleculo技术可以利用Illumina HiSeq2000平台，产生长的、精确的DNA测序读取，跨越1.5-15千碱基对。

　　长读取技术的另外一个例子是454 GS FLX+系统，它可以产生1000多个碱基对的读取。现在，一个研究财团正在利用这种测序技术，分析和装配RP11人类参考基因组，这是关闭缺口和发现基因组序列中新基因的一部分努力。

　　454生命科学（罗氏公司）研究和开发副总裁Todd Arnold称：“454最出名的事情之一是，它具有最高的质量和最长的测序读取。”读长和通量只会变得更好，他说：“我们要争取的是，当我们增加读长的时候，还能保持我们的质量分，因为这对于我们的客户是非常重要的。”

　　但是根据Korlach介绍，其他现有的技术将永远无法赶上PacBio。他说：“有基本的技术差异和限制，使其他商用技术不能提供我们可以提供的连续单个读取长度。”

　　即便如此，PacBio长读取技术的一个缺点是它的高错误率。虽然可以通过建立共识序列，获得高精确度的测序结果，但PacBio RS仪器可产生的单次读取，平均只有87%到89%的核苷酸准确性。

　　公司产品管理高级总监Edwin Hauw说：“我们正在致力于改进这种情况，但是在很长一段时间内，精确度将可能会低于其他现有技术，因为我们的技术基本上是基于单分子的实时检测。”

　　测试长读取

　　在东京大学，计算生物学家Michiaki Hamada并不太在意那些错误率。他说：“在我看来，这些高错误率并不会引起严重的问题，因为大多数的误差，可以使用具有低错误率的短读取来纠正，例如Illumina测序仪产生的读取。”

　　在一项研究中，Hamada和他的团队开发出一种读长模拟器，称为PBSIM，可捕捉PacBio读长的关键特征。Hamada说：“我们的长期研究目标是，开发一种de novo装配器，用于PacBio等测序仪产生的长读取。但是，没有可用的模拟器，靶定特定一代的PacBio文库。”

　　在去年《Bioinformatics》的一项报道中，Hamada和他的研究团队使用PBSIM分析了13个PacBio数据集。在对PacBio读长进行混合纠错和组装测试后，他们发现，所获得的广泛装配结果，具有至少15×的连续读长覆盖深度，结合至少30×的圆形共识序列覆盖深度。Hamada说：“PBSIM不仅可用于评估PacBio测序仪的装配器，而且还可用于测序的实验设计。”

　　最后，因为参考基因组中的这些缺口，可能包含疾病相关基因，因此，利用长读取技术可以对临床领域产生巨大的影响。例如，在他们的研究中，Arnold及其同事确定了一个区域，可能参与了肿瘤的发展。Arnold说：“有证据表明，这个基因是由更早的RNA序列数据产生，但是它并没有出现在参考基因组中，所以重新测序的任何人都不会看到它。参考文库越全面，你就越能够以积极的方式使用这些数据。”