多重等位基因特异性PCR芯片在听力筛查中的应用

　　We demonstrate a new method, using a universal array approach termed multiplex allele-specific PCR-based universal array (ASPUA), and applied it to the mutation detection of hereditary hearing loss. Mutations in many different genes may be the cause of hereditary hearing loss, a sensory defect disorder. Effective methods for genetic diagnosis are clearly needed to provide clinical management. Owing to the broad genetic basis of this condition, clinical assay of such a highly heterogeneous disorder is expensive and time consuming. In ASPUA, the allele discrimination reaction is carried out in solution by multiplex allele-specific PCR and a universal solid phase array with different tag probes is used to display the PCR result. The purpose of developing the ASPUA platform was to utilize the rapidity and simplicity of the amplification refractory mutation system (ARMS) with the detection power of microarray hybridization. This is the first report of the combination of these two technologies, which allow for the completion of allele-specific detection of 11 of the most frequent mutations causing hereditary hearing loss in under 5 hr. The ASPUA platform was validated by accurately analyzing 141 patient samples that had been previously genotyped for GJB2, GJB3, SLC26A4, and MTRNR1. In addition, we also developed a simplified assay by using streptavidin-coated magnetic beads instead of fluorescence for signal display that can be assessed through a conventional light microscope. We demonstrate that the ASPUA platform is rapid, cost-effective, and easily-used, and is especially appropriate for mutation detection in clinical genetic diagnostics.

　　本文利用多重等位基因特异性PCR与通用芯片技术相结合（allele-specific PCR-based universal array，ASPUA）建立了一种新方法，并将其应用于遗传性耳聋基因突变检测。遗传性耳聋是一种感音性耳聋，位于多个不同基因上的突变均可导致该病，临床亟需有效的基因诊断方法。由于该病的遗传背景比较复杂，用于这种高异质性遗传病的基因检测方法不但昂贵而且耗时。而ASPUA方法，将等位基因辨别反应通过多重等位基因特异性PCR在液相中实现，然后利用固定了不同标签（Tag）探针的固相通用芯片将PCR结果展现出来。ASPUA平台的建立利用了扩增阻滞突变系统快速、简便的特点，与微阵列杂交方法高通量的特性，这是首次将这两种技术相结合的报导。应用该技术可在5小时之内完成导致遗传性耳聋的11种常见基因突变的检测。采用该技术已经精确分析了141份样品，这些样品是已经进行了GJB2，GJB3，SLC26A4和MTRNR1基因型分析的临床样品。除此之外，我们还建立了一种简化的方法，该方法采用链霉亲和素包被的磁珠代替荧光作为信号指示剂，可使用常规的光学显微镜对结果进行分析。综上，本文所建立的ASPUA方法是一个快速，经济，易用的检测平台，尤其适用于临床遗传检测的基因突变检测。

　　（以下为摘录的部分翻译内容）

　　已经作过分型的病人DNA样品分别由下列单位提供：中国人民解放军总医院，中国医学遗传学国家实验室；Thomas Jefferson大学；斯坦福大学医学院；布拉格Charles大学。

　　靠近5’端有15个碱基的多聚T序列、并且5’-端用氨基标记的探针被共价连接到醛基表面修饰过的玻璃基片（中国北京，博奥生物有限公司，以下简称博奥生物）上，用来捕获等位基因特异性的PCR产物。每种探针使用50%DMSO配制为15μM的浓度，使用SmartArrayer™ 48微阵列点样仪（博奥生物）以5个重复点的形式点制为微阵列芯片，其点径为约150μm，点间距为300μm。

　　多重等位基因特异性PCR被分开在两管中进行以避免某些引物对之间的相互作用。四个位点：c.35delG，c.547G>A，c.2168A>G，c.919-2A（IVS7-2A>G）同时在一管中进行扩增。其他的七个位点在另外一管中进行扩增。模板用量为50ng基因组DNA或者5pg质粒DNA。每对引物的浓度均独立地进行了优化。采用不对称PCR用以获得足够杂交使用的单链DNA。每次实验均包括一个PCR阴性质控（不加模板）。由于针对两个等位基因的引物都被加入反应体系，即使是纯合子至少其中一个等位基因的产物也必定会扩增出来，所以没有引入额外的PCR阳性质控。

　　将两管扩增反应产物混合起来。取5微升混合物，加入10微升杂交液。98摄氏度加热2分钟，在冰上冷却后移至芯片的子阵上，50摄氏度温育1小时，清洗两次（每次2分钟）。最后离心甩干。

　　使用商业微阵列芯片扫描仪和软件检测结果，取微阵列上每点信号的绝对中位信号强度（AMSI，信号强度中位值减去背景强度中位值的差值），使用最小值1000作为阈值。为了排除引物二聚体所造成的假阳性结果，一个等位基因的绝对中位信号强度必须比该等位基因的阴性质控大10倍以上。如果以上条件都满足，该等位基因的信号值则被记为阳性。

　　图1 ASPUA的原理。A：多种等位基因特异性PCR分两管进行（2.5小时）。进行不对称扩增以产生足够的单链标记DNA用以杂交和检测。B：变性之后，PCR产物与通用芯片进行杂交（1小时）。C：清洗过的芯片使用扫描仪进行检测。通过图像分析获得多个位点的基因分型结果（0.5小时）。

　　图1简明地概括了多重ASPUA的原理。使用热启动DNA聚合酶进行多重等位基因特异性PCR，然后PCR产物用来与通用芯片上的捕获探针进行杂交。用信号强度和标记探针在芯片上结合的位置来判读结果。对于每个位点，使用两个在3’端碱基不同的等位基因特异性引物来区分不同的等位基因。所使用的热启动DNA聚合酶缺乏3’-5’外切酶活性，因此如果PCR引物在其3’端与模板发生错配的话其扩增效率会大大降低。一个标记过的通用引物用来增加单链DNA。在ASPUA检测中，通用芯片扮演着显示之前扩增结果的解码工具的角色。该通用芯片之前已被验证能够保证杂交结果的特异性。

　　图2A显示了芯片的格式，其中QC和BC分别为点样效率的阳性和阴性质控，PC和NC为充当杂交阳性和阴性质控的寡核苷酸。PC为杂交体系中一种TAMRA标记的寡核苷酸的反义序列，而NC则与杂交体系中任意一种序列都不互补。微阵列芯片上子阵中的其他点均为用以捕获ASPUA方法PCR产物的标记探针。

　　为了证实等位基因特异性探针是否只扩增所期望的目标等位基因，以及这些突变的不同等位基因是否可以被特异地分辨出来，使用一个纯合子DNA样品作为模板和所有引物进行了扩增。仅有期望的目标等位基因被扩增出来。对于那些我们无法找到纯合子病人样品的突变，使用单个等位基因构建的质粒克隆来代替。

　　如图2B所示，只有正确的引物所对应的标记产生了明显的信号。每个突变体基因模板都产生了特异的信号。表1显示了特异性实验中5次重复试验的绝对中位数信号强度和标准差SD数据。5次重复试验中的所有阳性信号都满足材料与方法中所提出的两项标准。

 

表1 特异性研究中的绝对中位值信号强度和标准差数据

 

　　图2 ASPUA方法的特异性。A：每个探针均以五个重复点的形式排列。QC和BC为点样的阳性和阴性质控，PC和NC为杂交的阳性和阴性质控。其他的点均为各等位基因的捕获探针。数字代表11个突变的名称，分别（依次）为：c.34delG，c.167delT，c.176_191del16，c.235delC，c.299_300delAT，c.538C>T（p.Arg180X），c.547G>A（p.Glu183Lys），c.707T>C（p.Leu236Pro），m.1555A>G，c.2168A>G（p.His723Arg）和c.919-2A>G。W和M分别指示野生型和突变型。B：杂交试验的图像。P代表分子克隆方法构建的基因模板，hom表示纯合子（但对于m.1555A>G突变，hom代表分子克隆方法构建的基因模板）

　　在等位基因特异性引物3’端人工引入的错配碱基可以增强选择性杂交的特异性。降低引物的浓度也可以提高本方法的分辨能力，但是这两种方法的效率在PCR反应条件的一定范围内是不同的。为了研究这些效果，选择了m.1555A>G突变的野生型引物作为检测的目标，因为其在3’端具有一个T残基而常常具有较差的分辨能力。人工错配碱基被引入到从3’端算起的第3，5，9个残基位置（记为m.1555A>G-W3，-W5，和-W9）。由于发生在野生型引物和突变型靶序列之间的T-G错配，天然的野生型引物的分辨能力（DR）较低。减小引物的浓度可以增加特异性，但是这种方法也大大降低了扩增效率。相反，出现在引物3’端的人工错配在增加分辨能力的同时对扩增效率的影响很小。当人工错配位置逐渐远离3’端位置的时候，特异性逐渐下降。M.1555A>G-W3引物在突变模板数量增加、以及磁珠用量增大的条件下保持了高分辨能力。总而言之，m.1555A>G-W3引物在较宽的PCR条件范围内都表现良好。

　　已经预先分型的141份正常人和病人DNA样品得到了检测。ASPUA检测到的基因分型结果和这些样品的临床信息列在增补表2中。在141份受测样品中，122份样品来自耳聋病人，9份来自携带者。有1位被发现是m.1555A>G纯合子，但是没有表现出临床症状。9份来自普通人对照的样品未发现变异。

　　为了评估ASPUA方法所需要的最低样品量，我们使用了一种野生型基因组DNA的不同数量用于检测。表2种列出了5次重复试验得到的绝对中位数信号强度和标准差数据。绝对中位数信号强度随着目标数量减少而下降。在使用25ng基因组模板时，所有位点的绝对中位数信号强度值都在1000以上。然而在10ng水平时，有四个位点降到1000之下。我们发现使用多重置换扩增（MDA）技术可以扩展ASPUA的检测灵敏度。

 

表2 灵敏度研究中的绝对中位值信号强度和标准差数据

　　这里，我们结合多重等位基因特异性PCR和通用芯片（ASPUA），提出了一种用于同时检测导致遗传性听力损失的11种突变的、快速、经济的方法。这些突变，不管是仅有一个碱基突变的还是由长达16个碱基缺失的，都能够被精确地识别出来。该方法的特异性已用纯合子DNA进行了验证。酶促反应和通用芯片杂交的特异性保证了整个过程的高分辨能力。尽管某些突变位置接近，例如GJB3基因上相差仅9个碱基的两个位点，该方法都能够准确地检测。

　　在病例研究中，我们测试了141份样品来验证ASPUA方法的准确性。全部样品的结果与提供样品的实验室原先所作的基因分型结果均完全一致。由于病例DNA样品来自于不同的实验室，DNA的质量在一定程度上存在差异。但是这种差异并没有影响到检测的结果，而且所有的阳性结果都达到了检测标准。有1份样品被发现携带m.1555A>G突变，但是病人尚未表现出临床症状。这样的病人，氨基糖甙类抗生素应该被禁用以避免诱发耳聋。在准备本文手稿的同时，我们应用ASPUA对多达515份病人样品进行了检测，其结果与直接测序完全一致。

　　我们正在计划研发第二代遗传性耳聋检测微阵列芯片，并增加ASPUA方法检测的突变种类。我们已经证实将扩增反应分开到不同的管中使用互相兼容的引物组合和热启动DNA聚合酶进行可以达到充分的扩增效率，即使是在DNA的品质和数量有所差异的情况下。增加反应管的数目以检测更多的等位基因以及位点是最简单的方法，而且将一些新的基因位点增加到每个反应管中也可以马上被测试，如果扩增效率保持在高水平，则可以采纳。我们也证实原来杂交效率低下的等位基因，可以通过在3’端人工引入错配碱基大大改善其效果。这项方法可以用来对任意新增的非最优条件的等位基因进行测试。

　　ASPUA方法简便易用。虽然目前它的通量不是很高，但是很容易扩展。其他的耳聋基因分析平台采用了各种不同的途径。Siemering等提出的等位基因特异性寡核苷酸生物芯片从PCR到结果解释需7步操作，1天时间。Gardner等提出的APEX方法使用6步操作在6小时内完成，但是需要用到多通道的扫描仪和四色的多重荧光标记，从而增加了可观的成本。反观现在的ASPUA方法，可以在一张具有四个子阵列的芯片上同时完成4个样本的检测。整个过程可在5小时内分4步完成：DNA提取（1小时），PCR（2.5小时），杂交（1小时），扫描和自动结果判读（0.5小时），避免了纯化扩增产物和其他一些繁琐的步骤。还可以在仅稍微增加耗时的情况下处理更多的样品。如果使用12张具有4个子阵列的芯片对48个样品进行检测，总耗时仅增加40分钟用于样品处理。

　　虽然DNA测序可以获得完整的基因分型数据，并且与ASPUA方法一样迅速，但其设备成本却数倍与本技术。另外，传统的RFLP或者斑点印迹等位基因寡核苷酸（ASO）方法，都会随着检测突变的种类或者检测样品数目的增多而使劳动强度大大增加。在ASPUA方法中，PCR产物可以直接用于杂交而不必进行纯化，也不必插入标记有染料的ddNTP，从而节省成本。通用芯片可以适用于不同的检测，从而也降低了成本。

　　综上所述，我们将等位基因特异性PCR与通用微阵列芯片技术结合起来，创造了一种用于对导致遗传性听力损失的基因突变进行检测的方法ASPUA。等位基因特异性PCR的特异性和简单性保证了基因分型结果的高准确性。对于常规诊断实验室，ASPUA具有一些独特的优点。现在，我们应用它对11种突变进行多重检测。ASPUA通用芯片使得多重检测具有高度的灵活性，而且基因位点的数目还可以增加。微阵列芯片的格式还可以被重新设计，用以在一张芯片上同时检测更多的样品。