Qtrap5500：生物标志物确证分析的最佳技术平台

　　2010年5月15日~17日，在云南丽江召开的蛋白质组数据处理暨第三届全国生物质谱学术交流会上， AB SCIEX公司于15日中午举办了新技术推广&午餐招待会。来自AB SCIEX公司质谱市场产品经理刘麟先生，向大家介绍了AB公司Qtrap 5500在蛋白质组学定量分析中的新技术及其新应用。

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AB SCIEX公司新技术推广和午餐招待会现场

AB SCIEX公司质谱市场产品经理 刘麟先生

　　高效实现强大的MRM³定量方法

　　AB Sciex公司推出的Qtrap 5500系统具备更高的灵敏度、更好的阱内裂解效率、更快的扫描速度以及更快的MRM³扫描方式。在分析生物样品时，样品一般都较为复杂，所以在某些特殊的情况下，分析人员需要选择性更高的检测技术，MRM³技术便能够帮助分析人员解决上述问题。

　　所谓MRM³扫描方式就是通过Qtrap 5500质谱系统与液相色谱相配合，在Q1选择一个前体离子，在Q2中将该离子进行碎裂，与MRM扫描方式不同在于MRM³扫描方式是将所有的碎片离子聚集在线性加速离子阱中，之后，在离子阱中以高达10K或20KDa/Sec的速度扫描特定的二代碎片离子，从而获得MRM³谱图。

　　那么，什么时候需要使用MRM³扫描方式呢?刘经理给出的答案是：(1)MRM扫描背景噪音较高，或谱图中有干扰峰存在；(2)通过更换流动相、优化液相色谱条件、选择不同的MRM离子对、选择不同的离子化方式等这些简单方法无法消除背景噪音；(3)与背景噪音相比，没有特定的MRM子离子可用，在遇到上述这些干扰和困难时，MRM³就是一种有效的定量策略。

　　接下来，刘经理具体例举了通过MRM³扫描方式定量检测血浆中多肽药物Exenatide和血浆中前列腺特异性抗原(PSA)这两个例子。Exenatide在临床上用于治疗II型糖尿病，分子量为4186.6Da。通过选择MRM和MRM³这两种定量扫描方式进行比较，得出血浆样品中的背景干扰影响了MRM的选择性，定量下限(LOQ)大概是100ng/mL，而采用MRM³扫描方式完全消除了干扰物，LOQ提高了20倍以上。

　　前列腺特异性抗原(PSA)是临床诊断前列腺癌的主要指标，在临床上通常采用ELISA的方法进行检测，该实验分别对四组样品进行MRM³和ELISA方法进行比对分析，得出两种技术检测结果相近。

 

　　脂质分析

　　脂类物质是细胞膜的重要组成成分，在细胞功能上扮演着重要的角色，所有的脂类都有一个极性头部和熟睡的尾巴，或至少是代谢后生成此类分子。作为细胞能量储存，并且参与细胞间的信息交换。了解脂类代谢途径有益于设计高效且副作用小的药物，对于生物体生理过程和药物设计有着重要的意义。譬如阿司匹林、布洛芬与脂类代谢相关，降低胆固醇的他汀药物，也能戏剧性的改变脂类代谢。

　　传统研究脂类物质的技术方法包括有：薄层层析、气相色谱以及气质联用技术。气质联用技术通常分析经分离纯化的脂类衍生物，但衍生化方法通常易导致脂类发生变化，破坏了脂类分子的完整性。

　　液质联用技术可以解决上述问题，帮助分析人员鉴定脂类、了解脂类类别、获得脂类的表达谱、比较脂类表达谱、获得结构信息、测定分子量以及代谢物定量。LC/MS/MS不同于GC/MS，它可使研究人员能够观察到完整的脂类分子，直观地看到何种脂肪酸连接在头部基团上。

　　刘经理指出目前运用液质联用技术进行脂质分析仍处在不断地发展过程中，该分析平台也可分为已发现标志物(Targeted)和寻找标志物(Non-Targeted)这两大类，前者主要检测已知样品的质量数，通过统计学分析确定这些分子在大量样品中的变化，从而进行定量分析；后者则要找到样品中存在的差异，鉴定哪些质量数在样品中存在差异，主要进行定性分析。

　　了解脂质的多样性包括有(1)每一类别中酰基或烷基链长度和不饱和度的不同；(2)脂质提取物的质谱数据中包含许多质量数相同但结构不同的分子；(3)选择不同的溶剂，将严重影响不同类别脂质分子的离子化效率和离子抑制。刘经理在这里指出如通过targeted methods(目标性方法)进行脂质分析，譬如前提离子扫描和中性丢失的扫描方式，既可降低复杂性，又可同时平行扫描数百种脂类分子。

 

　　多重全体离子扫描方式(MPIS)

　　多重全体离子扫描方式(Multiplexed Precursor Ion Scanning， MPIS)便可实现上述的检测分析，多重全体离子扫描方式具体指指固定在Q3扫描某个碎片离子，通过分析检测出哪个前体离子会产生出该碎片离子，并将该离子的信号记录下来。通过这样反复不断地扫描，便可以推导出哪些前提离子将会产生某一个碎片离子。该方法的技术优势在可对所有感兴趣的脂类分子和内标分子进行平行检测，图谱了直观解析并可以叠加用于复杂脂类的定性分析，可方便的从前提离子扫描切换到MRM扫描，用于脂类分子的定量分析。

　　刘经理例举了通过多重全体离子扫描方式检测非酒精性脂肪肝病人肝脏组织中磷脂和脂肪酸的表达谱。之所以对上述两种脂类分子进行检测，是由于磷脂酰胆碱(PC)与磷脂酰乙醇胺(PE)的比值可用于监测肝细胞膜的完整性，脂肪酸的表达谱能够深入了解肝酶活性和脂肪代谢。该实验技通过直接进样的方式检测肝细胞和血细胞脂类提取物中磷脂和脂肪酸的表达谱。

　　实验流程采用Qtrap 5500系统，利用其正离子和负离子扫描可以在一次实验中进行和每个循环周期60次前体离子扫描或中性丢失扫描的优势。在样品进样方面，刘经理着重介绍了Advion NanoMate直接进样纳喷雾系统，该系统装有96孔板，在每个孔上配有Nano离线喷针，每一个离线喷针里装有脂类物质，所以能够不断连续的、离线的进行喷雾，无需再接液相。

　　在数据分析方面，该实验用到了LipidView^TM软件，刘经理介绍到该软件功能十分强大，不但可以进行数据库检索，同时也可对脂类分子进行定量分析。该数据库中现有44类，约23000种脂质分子，大于600个脂类特征碎片离子信息，该软件支持AB Sciex所有型号的LC/MS/MS。

　　通过分析得出结论：(1)患有非酒精性脂肪肝病人的长链脂肪酸(大于20个C)的表达量远远高于正常人；(2)在负离子扫描模式下，病人与正常人的磷脂酰胆碱表达量没有太大的差别，但在正离子扫描模式下，病人与正常人相比长链磷脂酰胆碱的表达量显著减少；(3)非酒精性脂肪肝病人样本中，与正常人对照组相比较，磷脂酰乙醇胺保持相对稳定。

　　通过对PC和PE数据进行比较发现，在肝细胞中病人的PC/PE比值明显低于正常人。单从PC数据来看，无论是在正离子还是负离子的扫描模式下，病人的PC表达量要远远低于正常人，又由于正常人和病人的PE表达量基本一致，所以得出结论：PC表达量的较少，导致病人的PC/PE值低于正常人群。在血细胞中病人与正常人的PC/PE比值基本一致，说明非酒精性脂肪肝病症主要是由于肝细胞膜发生变化所导致的。

　　在刘经理精彩的报告后，AB Sciex公司还特设有抽奖环节，并为获奖嘉宾精心准备了一份小礼物。

浙江工商大学张虹教授 上台抽出幸运嘉宾