博纳艾杰尔科技：奶粉中激素样品前处理方法

奶粉中雌酮、雌二醇、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮 SPE-LC/MS/MS检测方法

　　1.实验部分：

　　1.1材料、试剂

　　Cleanert PEP吡咯烷酮化聚苯乙烯/二乙烯基苯固相萃取柱(100mg/6mL, P/N: PE1006，博纳艾杰尔科技)；Cleanert Silica CM改性硅胶固相萃取柱 ( 1000mg/6mL , P/N : CM0006，博纳艾杰尔科技)

　　液相色谱柱 (Halo C18 , 2.1×100mm, 2.7μm, P/N: 92812-602，博纳艾杰尔科技)

　　标准品：雌酮(CAS.No. 53-16-7)、雌二醇(CAS.No. 50-28-2)、醋酸甲地孕酮(CAS.No. 595-33-5)、醋酸氯地孕酮 (CAS.No. 302-22-7 )，购自中国药品生物制品检定所。

 

　　1.2样品前处理方法

　　1.2.1 Cleanert PEP样品提取净化法

　　提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 80% 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心(90000r/min， 6min)取3mL上清液，加入9mL超纯水稀释，涡旋混匀后，待过Cleanert PEP柱净化。

　　净化步骤：

　　1) 活化：以5mL乙腈，5mL水活化Cleanrt PEP；

　　2) 上样：把上述稀释后的样品溶液过柱，流速控制以1mL/min为宜；

　　3) 淋洗：待样品溶液完全通过小柱后，用5mL 5%乙腈淋洗小柱，然后真空抽干3min；

　　4) 洗脱：以3-5mL乙腈洗脱目标，收集流出液；

　　5) 浓缩：收集液以氮气浓度吹干(40℃水浴)，后以50% 甲醇水定容至1mL，混匀后过0.22μm微孔滤膜过，进LC-MS/MS分析。

　　1.2.2 Cleanert Silica样品提取净化法

　　提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心(9000r/min， 6min)取3mL上清液，待过Cleanert Silica柱净化。

　　净化步骤：

　　1) 活化：以5mL乙腈活化Cleanrt Silica小柱；

　　2) 上样：把上述提取液过柱，收集流出液；

　　3) 淋洗：以5mL乙腈洗涤小柱，收集流出液；

　　4) 浓缩：合并以上流出液液，以氮气浓度吹干(40℃水浴)，后以50% 甲醇水定容至1mL混匀后过0.22μm微孔滤膜，进LC-MS/MS分析。

 

　　1.3 LC-MS/MS检测条件

　　1.3.1 孕激素(醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮)测定

　　液相色谱条件：色谱柱 (Halo C18， 2.1×100mm, 2.7μm)；流动相：A：0.1%甲酸水，B: 甲醇，梯度条件(略)；流速：0.3mL/min，柱温：40℃,进样量：10μL

　　参考质谱条件：电离源：电喷雾正离子模式；其他(略)

　　1.3.2 雌激素(雌二醇、雌酮)测定

　　液相色谱条件：色谱柱(Halo C18 2.1×100mm,2.7μm)；流动相：A：水，B: 乙腈，梯度条件(略)；流速：0.3mL/min，柱温：40℃, 进样量：10μL

　　参考质谱条件：电离源：电喷雾负离子模式；其他(略)

 

　　2.结果与讨论：

　　结果见图1、图2。用Cleanert PEP (反相)或Cleanert Silica CM(正相) 两种净化手段均可到达满意的回收率和净化效果，添加浓度在25ppb时回收率可达到80% 。

　　用Halo色谱柱可以实现样品的快速分离，大大提高工作效率。

　　雌二醇和雌酮两种激素，质谱相应偏低，质谱条件需要进一步优化。

　　本实验结果采用单点定量判定，结果可能有失偏颇，详细数据需做基质添加标准曲线确证，方法的精密度，稳定性等亦需要进一步确证。

 

图1 两种孕激素总离子流图和选择离子流图(标品)

图2 两种雌激素总离子流图和选择离子流图(奶粉样品)

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