凝胶层析法分离蛋白质原理

　　所谓层析，就是利用样品中各组成成分的理化性质的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速率不同，从而把它们分离开来的技术。这些物理特性包括分子的大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性质等。层析系统的必要组分有：

　　a. 固定相，可以是一种固体、凝胶或固定化的液体

　　b. 层析床，把固定相填入一个玻璃或金属柱中，或者薄薄涂布一层于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纤维纸上。

　　c. 流动相，起溶剂作用的液体或气体

　　d. 运送系统，用来促使流动相通过层析床。

　　e. 检测系统，用于检测试管中的物质。

　　由于不同物质固定相相互作用的强弱不同，从而使得分离目的得以实现。

　　要点：层析系统中，与固定相作用强的物质受到的阻力最大，而作用弱的物质受到的阻力很小，因而不同物质在层析过程中的迁移距离和洗脱时间不同。

　　介绍凝胶层析的概念。凝胶层析又称分子筛层析，主要根据混合物中分子的大小和形状不同 ，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔，流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。

　　在凝胶层析中常用的凝胶有葡聚糖凝胶(商品名Sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel-P)和琼脂糖凝胶(Agarose)。葡聚糖凝胶是由细菌葡聚糖(又称右旋糖苷)在糖的长链间用交联剂1-氯-2，3-环氧丙烷交联而成。在合成时，调节葡聚糖和交联剂的比例，可以获得具有网孔大小不同的凝胶。G值表示交联度，G值愈大，交联度愈小，网孔和吸水量越大。

　　本实验通过SephadexG50层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，分离血红蛋白(红色，分子量约64500)与硫酸铜(蓝色，分子量249.5)的混合物，从颜色的不同可观察到血红蛋白洗脱快，硫酸铜洗脱较慢。