发布时间:2016-11-19 12:24 原文链接: 盘点:31项与免疫学有关的分子生物学实验技术

  现代分子生物学和免疫学的进展加深了我们对许多疾病的了解,并且导致了免疫新策略的产生,免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫测定。本文盘点了与免疫学有关的分子生物学实验技术汇总。

  一、GST pull-down实验

  GST是指谷胱甘肽巯基转移酶,GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。

  GST pull-down实验是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”;目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白;“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

  二、足迹法(Footprinting)

  足迹法全称为DNA footprinting,又称DNA足迹法或DNA足纹技术,能鉴定启动子区域特殊位点的功能。

  Footprinting是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法,用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合,也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。当DNA和蛋白质结合后,DNA与蛋白的结合区域不能被DNase(脱氧核糖核酸酶)分解,在对目的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(蛋白质结合区),从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。

  三、染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)

  ChIP是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。

  在生理状态下,把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化及鉴定。

  四、基因芯片技术

  基因芯片又称DNA芯片、生物芯片技术,基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。

  通俗地说,就是通过微加工技术,将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针),有规律地排列固定于50px2 的硅片、玻片等支持物上,构成的一个二维DNA探针阵列,被称为基因芯片。基因芯片主要用于基因检测工作 。

  基因芯片的测序原理是杂交测序方法,即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法,在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时,通过确定荧光强度最强的探针位置,获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。

  五、高效液相色谱(HPLC)法

  HPLC是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。

  高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中,然后从检测器的出口流出,这时整个系统就被流动相充满。当欲分离样品从进样器进入时,流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离,分离后不同组分依先后顺序进入检测器,记录仪将进入检测器的信号记录下来,得到液相色谱图。

  六、酵母双杂交(Y2H)

  酵母双杂交由Fields在1989年基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。 GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域。

  Fields建立了一个双杂交系统,能够识别位于GAL4效应基因的上游激活序列(UAS)、位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA-BD)与X蛋白融合,能够启动UAS下游的基因进行转录、位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域(AD)与Y蛋白融合,如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个结构域重新构成,则会启动特异基因序列的转录。

  DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应,但是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录。

  七、噬菌体展示技术

  噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白的表达而表达,同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。

  肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱,经过3轮~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后,与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集,所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。

  八、RNA提取(Trizol法)

  Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。

  九、RT-PCR

  RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。

  实验步骤主要包括:1)RNA的提取;2)反转录合成cDNA;3)PCR扩增;4)产物的电泳和结果的测定。

  十、实时荧光定量PCR(Q—PCR)(Real-time Quantitative PCR )

  利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值(扩增产物荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数)和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。

  十一、BCA法测蛋白质浓度

  二价铜离子在碱性的条件下,可以被蛋白质还原成一价铜离子,一价铜离子和独特的BCA溶液相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子,形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性,吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系,因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

  十二、大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α)制备

  E.coli DH5α制备主要操作步骤:

  1)挑取受体菌(DH5或DH10B)的单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜(约16小时);2)取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中,在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时(250-300rpm);3)将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷;以下步骤需在超净工作台和冰上操作;4)吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中,在冰上冷却10分钟;5)4℃下3000 g冷冻离心5分钟;6)弃去上清,加入100μL预冷0.1M CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮,在冰放置20分钟;7)4℃下3000g冷冻离心5分钟;8)弃去上清,加入100μL预冷0.1M CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮;9 )细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15%-20%甘油)后超低温(-70℃)冷冻贮存备用。

  十三、碱变性提取质粒DNA

  碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。

  质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离:当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

  十四、目的基因的连接、转化及克隆筛选

  总过程:分-——PCR分离目的基因;切-——限制性内切酶切割;接-——目的基因与载体相连;转-——转入宿主细胞;筛-——筛选阳性重组体。

  1)分-——PCR分离目的基因:PCR克隆、同源克隆、文库筛选;2)切-——限制性内切酶切割:粘性末端、平末端;3)接-——目的基因与载体相连;4)转-——转入宿主细胞;5)筛-——筛选阳性重组体。

  十五、RNA干扰(RNAi)

  RNA干扰是将一些小的双链RNA通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。

  十六、cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术

  RACE技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。

  简单的说,即一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端,进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法,目前已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

  十七、基因文库和cDNA文库的构建

  基因文库构建需要首先得到mRNA,再反转录得cDNA,经克隆后形成文库。将载体导入到受体细菌或细胞中,使得细胞包含了一个基因组DNA片段与载体重组DNA分子,经过繁殖扩增,许多细胞一起包含了该生物全部基因组序列,形成的集合体叫做基因文库。基因文库与基因组文库(又名基因库)的区别在于基因文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分,便于DNA重组时直接使用。

  十八、mRNA差异显示技术(DD-PCR)

  mRNA差异显示技术是将mRNA逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。mRNA DDPCR 技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速而行之有效的方法:从基因背景相同的2个或几个被比较的细胞系或组织中提取总RNA,逆转录成cDNA ,用不同引物对,进行PCR 扩增,扩增时加入同位素标记的核苷酸。利用测序胶电泳技术分离PCR 产物,经放射自显影即可找到差异表达的基因。

  十九、抑制差减杂交

  抑制差减杂交技术原理抑制差减杂交技术(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR和DNA差减杂交方法相结合的方法。其依据的主要技术有两点:(1)消减杂交;(2)抑制PCR。经抑制差减杂交后的cDNA群体不仅富集了差异表达基因(目的基因),而且目的基因间丰度的差异经过均等化作用已基本消除,使消减后的cDNA群体为丰度一致的目的基因群体。

  二十、蛋白质芯片

  蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术,可用于蛋白质表达谱分析,研究蛋白质与蛋白质的相互作用,甚至DNA-蛋白质、RNA-蛋白质的相互作用,筛选药物作用的蛋白靶点等。

  蛋白质芯片是对固相载体进行特殊的化学处理,再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等),根据这些生物分子的特性,捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等),经洗涤、纯化,再进行确认和生化分析。

  二十一、Northern blot

  Northern blot是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法,通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。该方法首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分,然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。

  二十二、Southern blot

  Southern blot即Southern印迹杂交,是1975年由英国人Southern创建,是研究DNA图谱的基本技术,是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。该方法包括两个主要过程:1)将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,即印迹(blotting);2)固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火,即分子杂交过程。

  二十三、荧光共振能量转移

  荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中,如果一个荧光基团(供体 Donor)的发射光谱与另一个基 团(受体 Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠,当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于100Å),就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象,即以前一种基团的激发波长激发时,可观察到后一个基团发射的荧光。

  简单地说,就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程,此过程没有光子的参与,所以是非辐射的,供体分子被激发后,当受体分子与供体分子相距一定距离,且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时,处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体,使受体被激发,在整个能量转移过程中,不涉及光子的发射和重新吸收。如果受体荧光量子产率为零,则发生能量转移荧光熄灭;如果受体也是一种荧光发射体,则呈现出受体的荧光,并造成次级荧光光谱的红移。

  二十四、双分子荧光技术(BiFC)

  BiFC分析技术是一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达,如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用。

  BiFC分析利用绿色荧光蛋白(GFP)及其突变体的特性作为报告基因,将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段,再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近,就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近,重新形成活性的荧光基团而发出荧光。

  在荧光显微镜下,就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用,并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性,以及细胞信号分子对其相互作用的影响等,这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。

  二十五、双向凝胶电泳(2-DE)

  双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

  电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色,然后用相关软件对电泳图象进行分析。

  二十六、mRNA的分离与纯化

  mRNA的分离方法较多,以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A+)的特点,在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的mRNA。

  二十七、His-tag纯化蛋白

  His•Tag序列(6、8或10个连续的组氨酸残基)与固定在基于NTA(氮川三乙酸镍) -和IDA -的His•Bind树脂上的二价阳离子Ni2+结合。洗去未结合蛋白后,用咪唑或稍低的pH洗脱并回收目标蛋白。该通用系统使得可在温和、非变性条件,或存在6M胍或尿素条件下纯化蛋白。

  二十八、RNA酶保护试验方法(RNase Protection Assay,RPA)

  RNA酶保护法是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。

  该法将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交,标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合,形成双链RNA;未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸,而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA,免受RNA酶的消化,故该方法命名为RNA酶保护实验。

  二十九、用于流式细胞仪的IL-17家族抗体

  IL-17家族配体是诱导局部细胞因子产生的促炎症细胞因子,并参与了免疫功能的调节,主要是变态反应。

  IL-17家族抗体包括6个成员:IL-17、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也就是IL-25)和IL-17F是结构相关的蛋白,在C端附近有着保守的半胱氨酸结折叠,N端的序列差异相当大;IL-17家族成员激活三个受体——IL-17 R、IL-17B R和IL-17 RC;两个与IL-17 R同源的孤儿受体分别命名为IL-17 RD和IL-17 RE,它们的功能配体目前还不清楚。

  三十、各种分子标记技术的比较

  1)限制性片段长度多态性(RFLP)

  RFLP是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。

  RFLP可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。

  2)随机扩增多态DNA (RAPD)

  RAPD技术建立于PCR 基础之上的分子标记技术,基本原理是利用一个随机引物(8~10 个碱基)通过PCR 反应非定点地扩增DNA 片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA 多态性研究。对任一特定引物而言,它在基因组DNA 序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。

  由于RAPD独特的检测DNA 多态性的方式使得RAPD 技术很快渗透于基因研究的各个领域。

  3)扩增片段长度多态技术(AFLP)

  AFLP又名限制片段选择扩增技术,是1993 年由荷兰KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等发明。AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来,并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA 片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术。

  AFLP 指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。

  4)卫星DNA(SSR)

  SSR 是一类由几个碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即(CA)n和(TG)n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10~60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同,导致了SSR 长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础。

  4)单核苷酸多态性(SNP)

  SNP被称为第3 代DNA 分子标记,是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入 ,更常见的是单个核苷酸的替换,且常发生在嘌呤碱基(A 与G)和嘧啶碱基(C 与T)之间。

  SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异,被认为是应用前景最好的遗传标记。

  三十一、 时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)

  TRFIA 所使用的荧光标记物是镧系稀土金属,镧系稀土金属离子螯合物荧光很宽的Stokes 位移使其容易通过波长分辨方式进一步区别于背景荧光,提高方法学的稳定性。

  由于镧系稀土金属离子螯合物有很长的荧光寿命(微秒级),有别于传统荧光的短荧光寿命,使其能通过时间分辨方式区别于背景荧光(钠秒级),正是由于荧光衰变时间长,可以延缓测量时间,待测样品中短寿命的本底荧光衰变后再测稀土离子的特异荧光,因此可完全消除本底荧光的干扰。

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