pcr产物的纯化与回收实验报告

　　PCR产物的直接纯化：

　　一、原理

　　PCR产物一般都含有过量的引物、 Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程,因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多,商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。本实验中, Buffer PCR-A促使大于100bp的DNA片断选择性地吸附到 silica膜上。经 Buffer W. BufferW2洗涤去除残留在sica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料或放射性同位素标记的单核苷酸后,吸附到sica膜上的DNA片断经微量水或 Eluent洗脱下来,即可用于各种分子生物学的操作。

　　二、材料与方法

　　1、材料PCR产物

　　2、仪器、用具

　　恒温孵育器(65C)、离心机、移液器、1.5ml离心管

　　3、试剂

　　Buffer_PCR -A Buffer w1；已加无水乙醇的 Buffer V2 Eluent或去离子水

　　4、方法

　　(1)在PCR反应液中加入3倍体积的 Buffer PCR-A若需加入的 BufferPCR-A不足100ul,则加入100ul。

　　(2)将DNA --prep Tube置于2 -ml Microfuge Tube中,将步骤(1)中的混合液移入DNA -prep Tube I中,5500rpm离心1min。

　　(3)弃滤液,将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube中,加入500 ul Bufer W1,5500rpm离心1min。

　　(4)弃滤液,将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube中,加入700山已加无水乙醇的 Buffer V2,5500rpm离心1min,以同样的方法再用700山己加无水乙醇的 Buffer\2洗涤一次。

　　(5)弃滤液,将DNA -prep Tube置回到原2 -mi Microfuge Tube中1400opm离心1min

　　(6)连滤液一并弃掉收集管,将DNA -prep Tube置于一新的1.5ml离心管中,在sia膜中央加入25-30 ll Eluente或去离子水(65℃预热)

　　(7)室温静置2min,1400opm离心1min洗脱DNA。

　　(8)取5山样品,1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果

　　PCR产物切胶回收:

　　1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,计算凝胶重量。(100mg凝胶,计100ul体积)(尽量缩短暴露UV灯下的时间）。

　　2、加入3个凝胶体积的 Buffer DE-A(600uD,混合均匀后,于65°C加热,直至凝胶完全熔化。

　　3、加0.5个 Bufifer DE-A体积的 Buffer DE-B(300uD,混合均匀,当分离的DNA片段小于400bp时,加入1个凝胶体积的异丙醇。

　　4、吸取3中的混合液,转移到DNA制备管(置于2ml离心管中),12,000×g离心1min弃滤液。

　　5、将制备管置回2ml离心管中,加500 ul Buffer W,12,000×g离30sec弃滤液。

　　6、将制备管置回2ml离心管中,加700 ul Buffer W2,12000×g离心30sec弃滤液。重复一次。

　　7、将制备管置回2ml离心管中,12,000Xg离心1min彻底去除残余的液体。

　　8、将制备管置于1.5ml离心管中,在制备膜中央,加25~30ul65 Eluent或去离子水,室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA