仁济医院房静远：从lncRNA入手，寻找胃癌的生物标志物

　　上海交通大学附属仁济医院房静远教授主要从事消化系统肿瘤发生的分子机制、早期诊断和分子治疗等相关研究。近期，该课题组应用美国Arraystar公司的lncRNA芯片分析了胃癌组织的lncRNAs表达情况，筛选到可预测胃癌发生的分子标志物GClnc1，并且阐明了GClnc1在胃癌的发生和发展中是如何发挥调控作用的。该研究成果于2016年发表在国际著名学术期刊Cancer Discovery(影响因子19.783)上。（芯片实验由康成生物提供技术服务）

　　研究背景

　　 胃癌（GC）是一种常见的恶性肿瘤之一，其发病率在癌症患者中位列第四。由于早期缺乏特异性症状，大多数患者被诊断时已经处于胃癌晚期。晚期胃癌患者的预后较差，并最终死于术后的癌症复发和转移。近几年，科学家一直致力于寻找用于检测早期胃癌或者可以反映个体患癌风险较高的生物标志物，但是收效甚微。非编码RNAs是一类长度在200nt以上的长链非编码RNA，研究表明lncRNA的异常表达和癌症的发生有着紧密的联系，比如HOTAIR、MALAT1和H19等在癌症的发生中都扮演着重要的角色。前期已有文献报道lcnRNA在胃癌的发生中发挥重要作用，但是其具体的作用机制还需要进一步的探究。

　　 本文的研究目的就是借助lncRNA芯片来筛选可以用于检测胃癌的生物标志物，并通过大量的功能实验来验证异常表达的lncRNA是如何调控胃癌相关的信号通路。

　　研究思路

　　 作者首先检测了10个胃癌病人的胃癌组织和癌旁组织中lncRNA的表达情况（Arraystar human lncRNA v2.0），借助比较严格的筛选条件（原始信号值>1500, Foldchange>2以及P-value<0.01）找到了8个在胃癌组织中表达显著增加的候选lncRNAs。接着扩大样本进行RT-PCR验证，从而锁定了其中的4个lncRNAs进行后续的研究。

　　 接下来，作者对这4个lncRNAs做了临床分析（KM和ROC曲线），发现只有lncRNA BC041951的异常表达和胃癌是显著相关，并且BC041951的表达量从正常胃组织到胃癌的四个阶段是逐渐增加。因此，推测lncRNA BC041951可以作为预测胃癌发生的生物标志物，并进行后续的功能和机制研究，同时将lncRNA BC041951命名为GClnc1。

　　 为了进一步探究GClnc1和胃癌的关系，作者做了一系列的生物信息学分析以及功能性实验。作者先将GClnc1敲除，然后借助RNA-seq来筛选GClnc1可能调控的基因。通过RNA-seq找到异常表达的基因后进行基因集富集分析（GSEA），发现GClnc1调控的基因中大部分都是癌相关基因，比如c-MYC和CDK1等。同时，功能性实验也证明GClnc1可以促进癌细胞的增殖和入侵，最后促进胃癌的发生。

　　 lncRNAs可以通过和转录因子或者其他细胞因子结合来发挥功能。为了探究GClnc1具体的作用机制，作者利用RNA pull down实验和质谱来寻找GClnc1可能结合的蛋白。通过质谱实验，作者鉴定了近200个蛋白，同时选取了其中的10个和转录调控相关的蛋白进行WB验证。结果发现，只有蛋白WDR5和KAT2A可以和GClnc1特异性结合，其中WDR5是H3K4甲基转移酶，而KAT2A是H3K9乙酰转移酶。接下来，作者利用siRNA和RIP实验进一步证明了GClnc1可以特异性和蛋白WDR5以及KAT2A结合形成复合物。

　　 为了验证GClnc1是否可以调控蛋白WDR5和KAT2A在全基因组的结合位点，作者借助ChIP-seq和RNA-seq实验做了进一步的验证（GClnc1 shRNA VS control shRNA）。结果表明，GClnc1敲低后会导致蛋白WDR5和KAT2A在全基因组上的结合能力下降，进而使得相应基因的表达水平也会受到抑制。因此，作者推测GClnc1做为WDR5和KAT2A形成复合物的支架来调控两个蛋白对于组蛋白的修饰能力，进一步调控基因的表达和生物学功能。

　　 根据ChIP-seq和RNA-seq数据，作者发现超氧化物歧化酶SOD2是WDR5和KAT2A复合物的一个靶基因，并且根据CNC分析发现SOD2和GClnc1之间也具有高度相关性（正相关）。作者分析了GClnc1和SOD2在基因组上的位置关系，发现GClnc1的部分序列和SOD2的3’端的最后一个外显子重叠，并且经过生信分析发现两者之间不存在共同的miRNA结合位点。作者接着做了一系列的功能实验（GOF/LOF）来验证GClnc1以及SOD2的生物学功能，发现GClnc1确实可以通过调控SOD2来促进胃癌的发生和发展。作者接下来的目的就是研究GClnc1是如何调控SOD2来发挥生物学功能的。

　　 作者推测H3K4me和H3K9A可能调控基因SOD2的转录。RT-PCR和Westernblot实验也表明敲低WDR5或KAT2A可以减弱由GClnc1诱导的SOD2表达水平的上调。这就表明WDR5、KAT2A和GClnc1可能共同调控SOD2的表达（通过调控SOD2启动子组蛋白修饰）。接下来作者就对此进行了验证，ChIP实验表明WDR5和KAT2A可以直接结合在SOD2的启动子区域，并且发现敲低WDR5、KAT2A或GClnc1都会显著降低另外一种蛋白在SOD2上的结合能力，说明GClnc1在调控WDR5/KAT2A和SOD2启动子区域的结合过程中扮演着重要角色。作者进一步证明在SOD2启动子区域存在H3K4me3和H3K9Ac，并且改变GClnc1的表达水平，H3K4me3和H3K9Ac的丰度也会发生变化。ChIRP分析显示GClnc1直接结合在SOD2的启动子区域。

　　 上述研究表明GClnc1可以做为一个支架把组蛋白修饰酶WDR5和KAT2A招募至SOD2的启动子处，从而激活该基因的转录，进而促进胃癌的发生和发展。

　　研究意义

　　 本研究借助美国Arraystar公司的human lncRNA array在胃癌中筛选到大量异常表达的lncRNA，临床分析发现lncRNA GClnc1可以做为预测胃癌发生的生物标志物。接着，作者还做了大量的生信分析和功能实验来探究GClnc1是如何促进胃癌发生和发展的。总之，GClnc1可以做为治疗胃癌的一个潜在靶点；并且本研究的芯片数据对胃癌的诊断和治疗，以及探究非编码RNA的分子机制奠定了基础。

　　作者介绍

　　 房静远教授，医学博士，现任上海交通大学医学院附属仁济医院消化科主任医师、博士生导师，上海市消化疾病研究所所长、上海市消化内科临床质量控制中心主任、卫生部内科消化重点实验室主任、国家教育部重点学科核心小组组长、上海市重点（优势）学科带头人。学术专长：消化系统肿瘤诊断及治疗，在国际上首次发现叶酸可以治疗慢性萎缩性胃炎而预防胃癌。近年来承担多项973和863基金项目，并在权威杂志上发表文章150余篇，其中SCI文章33篇。