生物质谱——蛋白质组学研究的肱股之臣

　　分析测试网讯 2017年11月29日，由北京大学，首都科技条件平台主办，安特百科（北京）技术发展有限公司（分析测试百科网）协办的题为“生物质谱在蛋白质组学研究中的应用”的讲座在北京大学化学与分子工程学院化学楼A201报告厅举办，来自蛋白质行业的专家学者参与了此次讲座。

北京大学分析测试中心、美国密西根大学分析化学博士 周 文

　　此次讲座主讲人为北京大学分析测试中心、美国密西根大学分析化学博士周文，讲座分为三个部分，第一部分介绍了质谱的原理，然后是质谱在蛋白质组学研究中的应用，最后介绍北京大学分析测试中心质谱实验室及其应用。

　　质谱原理：

　　周文以Obitrap为例：质谱仪是非常精密的大型仪器，有非常多的附件在其中，日常客户中主要关心的部分：

　　1：离子源：对于生物大分子来说，现在应用最广的是电喷雾ESI，相对于之前很多离子化方法电是相当温和的，我们称之为软电离，2002诺贝尔化学奖颁给John Fenn和Koichi Tanaka,两位科学家，John Fenn凭借ESI，Koichi Tanaka凭借MALDI获奖。在很多年前，质谱用的都是能量非常强的离子化方法，有机小分子结构稳定，能完整的进入质谱里边去，质谱用来分析相对小一些的分子。直到ESI和MALDI广泛应用之后，相当于给生物大分子蛋白研究这头大象插上了翅膀，自从有了ESI和MALDI之后，才有了蛋白质组学比较蓬勃的发展。

　　2：质量分析器：种类很多，在蛋白质组学分析中，主流的是一类是轨道阱

　　Obitrap，优点：高分辨率，高精度，高灵敏度。现在最高灵敏度，高精度的是FTMS，Obitrap相较于FTMS来说，虽然指标和性能上稍微差一点，但是维护和使用上相对比较容易，所以Obitrap现在作为蛋白质组学研究的一类主流的使用仪器。

　　质谱在蛋白质组学中的应用：

　　蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学，分为若干个层次，第一层次：测完整蛋白的分子量，第二层次，蛋白序列，通过鉴别蛋白序列，得到到底是什么样的蛋白，第三层次，蛋白修饰；有什么样的修饰，修饰的位点在哪，前三个层次是蛋白的定性，第四个层次是定量的问题，尤其是当我们研究到蛋白质组时，更加必要。

　　蛋白质组学的实验流程：相对比较纯化的蛋白，通过酶进行特异位点的酶切，切成几十上百的段，肽段进入液质联用，得到质谱谱图，母离子的是一级谱图，碎片扫描的是二级谱图，然后做数据库的处理，与数据库里谱图对比。

　　质谱一级谱图和二级谱图：

　　一级谱图：不做碎片，在一个范围进行扫描，可以得到准确的分子量，但是却不能知道是什么肽段，因为不知道里边的氨基酸是怎么排列的，所以还需要做二级碎裂，得到它的碎片，

　　才能确定是肽段的碎裂。同理二级碎裂也可以得知在哪个位点上有修饰。

　　实验流程讲完之后，周文又举了几个例子：

　　案例一：未知蛋白的鉴定：未知蛋白经过酶切成肽段，肽段进入LC-MS得出谱图，搜索蛋白库，没有结果，然后测序High five细胞株转录组（High five昆虫细胞：常用于杆状病毒表达载体系统的重组蛋白表达），预测全蛋白序列，重新搜库，最后查到相对应的蛋白。

　　案例二：蛋白质修饰位点的鉴定：蛋白的翻译后修饰在众多生命活动中都起到非常重要的调控作用，很多课题组想找到蛋白都什么样的修饰，但是用质朴鉴定的难点：修饰率低：修饰可能不稳定；像一些糖基化修饰不会留在肽段上面。对于修饰率低的问题，解决方案是富集含有修饰的肽段，用抗体，磷酸化等，把不带修饰的肽段排除出去，留下的肽段全是带修饰的肽段；修饰不稳定问题，现在最常用的是CID/HCD都是碰撞类的解离，现在应用比较少的是电子转移阱（ETD）。ETD在分析比较脆弱的修饰有其独特的优势。

　　CID/HCD与ETD碎裂方式的对比图

　　案例三：基于二甲基化反应的相对定量：Hela细胞经过非天然糖代谢标记、富集蛋白，得到了的蛋白经过酶切得到肽段，肽段经过二甲基标记，得到轻组和重组的肽段，1比1混合，这个时候做一个二维的色谱分析，最后定量得到3200个蛋白，置信度很高。

　　北京大学分析测试中心质谱实验室

　　北京大学分析测试中心现有仪器：傅里叶变换高分辨质谱、轨道阱、飞行时间质谱、三重四级杆、高分辨气质联用仪、离子淌度质谱等，讲座结束后，周文邀请与会专家学者参观分析测试中心，专家学者就质谱相关的问题与周文详细探讨。

　　专家学者参观北京大学分析测试中心质谱室