CRISPR实验指南：如何检测CRISPR脱靶突变（一）

　　张锋实验室的一位研究生：Winston Yan的项目就是利用CRISPR-Cas9基因组编辑系统的一个突变来敲除调控小鼠胆固醇的基因。“最终的目的是为治疗应用铺平道路，”Yan说，他最近完成了他的研究生工作，同时也第一次遇到CRISPR脱靶效应的问题。

　　CRISPR能帮助研究人员快速有效地对基因组进行有针对性的切割。它的特异性和易用性使其成为了颇具潜力的工具，可用于去除缺陷基因，治疗遗传疾病或癌症，编辑作物的基因组增加其产量或抗病性等。

　　然而，研究人员也首先必须克服CRISPR的主要限制之一：不仅在其目标位置切割，而且在具有相似序列的非预期位置上也会进行切割。这些脱靶切割可能发生在整个基因组中，导致产生损害细胞功能或直接杀死细胞的有害突变。

　　要想研发检测CRISPR脱靶突变的方法并不容易，但在过去几年中，研究人员提出了各种新方法。The Scientist杂志最新介绍了这些方法。

　　计算机模拟预测与无偏差检测

　　CRISPR编辑的特异性差异甚大，其精确性的一个关键在于导向RNA（gRNA），也就是指导Cas9核酸酶在基因组上特定位置切割的RNA序列。

　　“即使在同一个生物体内，这个导向RNA可以让你完全不要考虑脱靶突变的问题，而另一个导向RNA可能会带来多达150个脱靶点，”德国RWTH亚琛大学的博士研究生Julia Jansing说。

　　为此，研究人员发现或设计了比常用Cas9特异性更强的其他核酸酶，减少了非靶标位点的数量，比如Cpf1核酸酶和Cas9的高保真度版本。

　　但是，即使是优化后的导向RNA或核酸酶，也有可能导致基因组发生无意改变。预测CRISPR脱靶活动的一种方法，就是使用基于导向RNA序列鉴定可能的脱靶位点的计算算法，研究人员在基因组切割之后再进行靶向测序，检查这些预测的脱靶位点突变。

　　每种算法都有自己的秘诀，其结果并不总是一致的。“预测工具有好有坏，你会得到不多不少的可靠性，”Jansing说。

　　目前尚未进行过生物信息学预测工具的系统性比较，因此研究人员只能根据他们的偏好性，或者是否支持他们研究的基因组来选择一个。比如说，研究小鼠或人类的研究人员比从事番茄研究的有更多的工具可供选择。

　　对于基础研究应用，如制作突变细胞系，这种预测工具可能更为合适，因为它相对快速，简单且便宜，而且通常足以准确分析脱靶突变不太多的情况，并且不会混淆对实验结果的解释。

　　但是这样的预测远非万无一失。

　　“我们是把这种内在的偏差放在我们正在观察的地方，因为我们假设我们了解Cas9是如何切割的，”Yan说， “但是从许多不同的研究来说，情况并非如此。”另外，计算预测可能过于宽泛。“你永远不会在数千个站点上进行PCR来寻找少量的脱靶，”他补充道。

　　为了克服目前计算机预测的局限性，研究人员开发了多种体外和基于细胞的技术，全基因组范围无偏差检测CRISPR脱靶突变。这些方法在开发治疗药物，甚至在临床前研究中至关重要，因为这些方法可以检测罕见和不可预见的脱靶编辑，这些编辑可能会对患者产生潜在的有害影响，例如激活致癌基因。

　　哈佛大学医学院病理学教授Keith Joung说：“监管机构可能会要求进行某种全基因组脱靶分析。”