ELISA实验中常见问题和注意事项

　　1 临床标本的收集和保存

　　用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）。本实验室用ELISA测定乙肝两对半，甲肝，戊肝，抗HIV的标本时，在处理和保存方面要考虑以下几个方面：

　　1）要注意避免出现严重溶血及血清中混有红细胞。当标本出现严重溶血及血清中混有红细胞时，反应孔不易洗净，残留在反应孔内的血红蛋白具有过氧化物酶的活性，显色时可能造成假阳性。

　　2）标本凝固不全强行离心，造成血清中含有少量的纤维蛋白原，在实验过程中形成纤维蛋白吸附在反应孔孔壁上不易洗掉，易造成假性结果。

　　3）血清标本可在2～8℃下保存1周。如血清样本需长时间保存，则需放入-20℃冰柜内冰冻保存。冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融，标本可能引起假阴性结果。此外冻融标本的混匀不要进行剧烈振荡，应反复颠倒混匀。

　　2 ELISA测定中试剂准备

　　在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，证试剂盒温度要和室温一致。如果把试剂盒从冰箱拿出来直接做实验会造成一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因为在后面的孵育反应步骤中，造成孵育时间不够。其次，ELISA实验中洗板用的洗液需每日更换配制，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。

　　3 加血清样本及反应试剂

　　血清样本使用微量加样枪加样。使用微量加样枪加样必须注意避免以下几点：

　　1）加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。需匀速加样，吸样时，加样枪需按到第一档，加样时，加样枪需直接按到底。

　　2）加样应直接加入反应孔底部，加在反应孔孔壁上易溅出会对邻近孔产生污染。尽量避免出现气泡。

　　3）反应试剂的加入时先要注意试剂的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出现重复滴加或加在两孔之间

　　4 温育的时间与温度

　　温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。温育温度应在37℃，水浴。温育时间应按照试剂说明书上的时间严格执行。温育实际测定操作中要注意以下几点：

　　1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。温育时间不够，弱阳性样本测不出来。

　　2）因为采用水浴，所以在温育时一定要封板，防止水蒸气形成水滴掉入反应孔内造成污染，并有可能整板花板。

　　5 ELISA测定的洗板

　　全自动洗板机的使用应注意以下几点：

　　1）洗板前，应检查洗液瓶、蒸馏水瓶是否充足，废液瓶是否满瓶

　　在自检过程中注意观察洗液灌注是否通畅，排液是否通畅。

　　3）在洗板过程中，应注意观察反应孔每孔是否灌满且无外溢，每孔吸水是否吸尽，并且要保证洗液在孔中放置的时间。

　　6 ELISA测定以TMB为底物的显色

　　加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效期。滴入A、B显色剂后，需温育15min，最后加入终止液终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定判断结果。在此过程中应注意不要把显色剂和终止液滴入顺序弄反，否则重做实验。

　　7 ELISA的比色测定

　　ELISA的比色测定由酶标仪进行测定，故需强调比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否是双波长（450nm和630nm）。

　　8 ELISA测定结果判定

　　结果判定一般是根据比色结果和肉眼观察综合判定。如在判定过程发现有些反应孔出现倒阴不阳的现象或出现不常见的模式（如乙肝两对半中出现12阳性等），需本着严谨的态度，重新复查。

　　对ELISA测定中出现问题的可能原因（非试剂盒本身的原因），总结如下：

　　1)弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题。

　　2）测定的重复性差，这是由于测定操作引起的问题，包括

　　①加样本及试剂量不准；孔间不一致

　　②加样过快，孔间发生污染

　　③加错样本

　　④加样本及试剂时，加在孔壁

　　⑤不同批号试剂盒中组分混用

　　⑥温育时间、洗板、显色时间不一致

　　⑦孔内污染杂物，

　　血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性等。

　　3）全部孔都不显色

　　①漏加酶结合物；

　　②洗板液配制中出现问题

　　③漏加显色剂A或B

　　④终止剂当显色剂使用

　　4）全部板孔均有显色

　　①板不干净

　　②显色液变质

　　③洗板液受酶等污染