荧光分光光度计安装与调试

一、安装前的准备

在签订供货合同后，距仪器的交货日期一般都有2～3个月的时间，为了保证购买的仪器能正常使用，通常购买方需在这段时间着手安装仪器前的准备事项了，以免因某些物品准备不及而推迟仪器的使用。

为充分发挥仪器的性能，使其长期处于稳定状态下工作，荧光分光光度计的安置场所需满足以下条件。

① 严格控制仪器室温度与湿度。 分析测试的室温应在5～30℃，仪器室的温度控制在20～25℃，相对湿度应控制在45％～85％，以避免因室温忽高忽低使荧光仪检测系统性能不稳定。

② 仪器附近应避开强磁场、强电场。保证没有强烈振动或持续的弱振动，附近没有产生高频波的仪器。

③ 环境中无腐蚀性气体和紫外范围内有吸收的有机和无机气体。

④ 配备高精度稳压电源，设立单独的地线。供电电源电压220V±10V，应避免与大负载设备的机器共用同一电源；设立单独的地线，地线接地电阻：<1000Ω,，以免外界的电磁干扰。

⑤ 仪器台应承重良好，台面水平。

⑥ 远离热源，如可燃性气体、电热器、电炉等。

⑦ 避开阳光直射，应在干净、灰尘少的仪器房。

要满足以上条件，购买方通常需要准备以下物品：

① 一台空调机，对于潮湿地区，还需配备一台抽湿机；

② 一台高精度交流稳压电源(规格3kW，单相220V)；

③ 用户必须做一条仪器专用地线 (和其它仪器的地线分开)，接地电阻小于1Ω；

④ 购买与用户方所需测样品相对应的化合物标准样品，以备验收仪器指标时使用；

⑤ 准备调试好仪器后，试机测试用的待测样品液；

⑥ 控制仪器用的计算机，以及打印机 (有些仪器厂商提供，则不需准备)。

如果，所购仪器为瞬态／稳态荧光仪，可能还需准备高纯氩气 (纯度大于99．999％)、高纯氮气 (纯度大于99．999％)、液氮等气体。

二、仪器安装与调试

仪器到货后，首先检查包装箱上的标识是否齐全，有些进口仪器用木箱装运，在木箱外包装上会有防振检验标记，如果在运输过程中发生一定程度的振动，标记会发生颜色变化，需认真查看。仪器安装与调试的大致流程如下。

(1) 开箱检查 一般仪器厂商都会派专业技术人员负责仪器的开箱、安装、验收与培训。用户方不可私自开箱，应在双方都在场的情况下，由厂商的技术工程师开箱，双方对照装箱单与供货合同仔细核对每一个仪器部件，确认配套的附件都有。核对产品合格证，操作使用手册，维修手册等是否齐备。

(2) 安装 等核对完每一个仪器部件都完好无损后，就由技术工程师准备安了。安装的顺序是先安装硬件，后装软件。①将串行线连接到计算机上与荧光仪主机相对应的端口。安装时使用的电源插座必须是具有良好接地端的三芯插座，按照仪器使用说明书的指导方法，连接主机接口与工作站接口、电缆和插头。②安装氙灯。在安装灯时，务必关掉主机、灯电源，将电源的电源线拔离，确认仪器完全断电，以防触电事故的发生。③在与仪器连接的计算机上安装仪器操作软件。

(3) 验收 仪器安装完毕，需对仪器进行调试验收。按照仪器操作使用手册的要求打开仪器，检查是否能正常显示和运行，检查仪器上的功能是否都能正常运行。在验收过程中，要针对每一个部件进行样品测试，检查部件能否正常工作。有条件的话，通常要对照仪器出厂时的性能指标用标准溶液作指标测试，测到的各项指标均需达到出厂时的标准。如果与合同规定的部件有出入或有器件损坏，可立即要求供货商赔偿或更换。验收完后要签订一个技术验收报告。用户可以提供自己的样品用新机测试，对测试过程中出现的问题可以随时请教现场的技术工程师，这样一方面有利于自己更快地熟悉仪器使用，另一方面，也使仪器的验收更有说服力。

(4) 培训 技术工程师对仪器使用者进行应用操作培训，主要讲解荧光仪的硬件组成、调试步骤、开关机顺序以及重要部件的维护保养等内容。一般仪器的安装调试过程也是一个培训过程，仪器使用人员应认真咨询仪器的使用、维护和售后服务及仪器相关损耗品的购买渠道等相关情况。仪器使用者在培训中应亲自用样品对仪器进行完整操作。有些仪器公司还会另外举行专门的技术培训讲座，对这个仪器的使用人员进行一次培训。

三、主要性能指标及测试方法

荧光分光光度计的性能指标通常包括：信噪比、波长准确度、波长重复性、检出限、线性、光谱校正误差、荧光池成套性、光谱仪探测范围、荧光寿命测量范围、光源、单色器、是否提供变温环境等。通过这些指标参数，可以对仪器的基本性能有大致了解。这些技术指标的测试方法可参照JJG (教委) 025—1996及JJG 537—2006《荧光分光光度计检定规程》，也可以参照仪器供应商提供的验收方法进行。校准的周期视情况而定，但是当条件改变(例如更换光源灯、光电倍增管等)或对测量结果有怀疑时，都应及时对仪器进行校准。对几个主要的技术指标测试方法介绍如下。

四、信噪比 (灵敏度) 测试

通常以纯水的拉曼峰的信噪比来测试荧光仪器的检测灵敏度。从谱图可以得到纯水的拉曼峰的峰高值S，以及噪声的平均值N，灵敏度=S／N，可以得到该仪器的灵敏度指标。具体操作步骤如下：

① 先打开氙灯，然后开仪器主机，预热30min。

② 将纯水以石英荧光池盛装后，放人仪器的液体样品架内。

③ 设置分析测试的参数，激发波长λem=350nm，发射扫描的范围300～430nm,激发发缝△λem=5nm，发射狭缝△λem =5nm，延时Dwell time=0．2s，水的拉曼峰λem =397nm。

④ 开始灵敏度测试实验：先以纯水调节灵敏度使发射波长λem =397nm，仪器示值在40％左右。再将发射波长退回到300nm，调仪器零位。扫描发射单色器，记录300～400nm发射光谱曲线。发射波长397nm附近的峰值即为S。然后在峰值处采用时间扫描记录2min，记录噪声曲线波动最大的峰值即为N。

⑤ 得到灵敏度测试指标(以5／N表示)。

五、波长准确度与重复性测试

分别测试激发单色器和发射单色器的波长准确度与重复性。

(1) 激发单色器的波长准确度与重复性测试 将发射单色器置零级位置，并将漫反射板 (或者无荧光的白色滤纸条) 放入样品室，仪器响应时问设置为“快”，扫描速度设置为“中”，使用实际可行的最窄狭缝宽度，对激发单色器350～550nm的波长范围进描，在所得谱图上寻找450．1nm附近的光谱峰，并确定其峰值位置。连续测量3次，按式1计算波长正确度：
3
△λ= ⅓ ∑λi—λr (4-1) 
i=1

式中λi——波长测量值；

λr ——汞灯参考波长值。

按公式2计算波长重复性：
3
δλ=max|λi— ⅓ ∑λi| (4—2)
i=1

按公式3计算波长准确度：

Uλ=△λ±δλ (4—3)

(2) 发射单色器的波长准确度与重复性测试 将激发单色器置零级位置，并将漫反射板(或者无荧光的白色滤纸条)放入样品室，仪器响应时间设置为“快”，扫描速度设置为“中”，使用实际可行的最窄狭缝宽度，对发射单色器350～550nm的波长范围进行扫描，在所得谱图上寻找450．1nm附近的光谱峰，并确定其峰值位置。连续测量3次，并分别按公式1～式3计算波长正确度、波长重复性与波长准确度。

六、线性测试

测量荧光分光光度计的线性，作为一个分析仪器测量范围方面的衡量指标，是十分必要的。其测试方法如下。

用0．05mol／L硫酸溶液作空白溶液，适当选择灵敏度挡和狭缝，依次测量表4-2的各浓度硫酸奎宁标准溶液。根据激发波长λem =350nm、发射波长在λem =450nm左右的原则，设定两侧的波长或选择滤光片。分别对表4-2中4种浓度的工作标准溶液与空白溶液进行连续交替3次的测量，计算每次测量的荧光强度平均值。用最小二乘法对4种标准溶液的浓度和荧光强度测量平均值进行处理，得到的线性相关系数，即为测量线性的结果。

七、分辨率测试

(1) 激发单色器的分辨率 扫描激发单色器应能分辨出汞三线365．02nm，365．48nm和366．33nm所对应的测量峰值。

(2) 发射单色器的分辨率 测扫描发射单色器应能分辨出汞三线365．02nm，365．48nm和366．33nm所对应的测量峰值。

八、光谱峰值强度的重复性测试

置激发波长λem =350nm，激发狭缝λem =10nm，发射狭缝λem =10nm，用1．00×10^-7 g／mL的硫酸奎宁溶液，调节灵敏度，使发射波长λem =450nm时，示值在80％左右，继续照射3min后，对发射波长365～500nm范围重复扫描3次。

由公式4计算重复性：
3
δF=max|Fi— ⅓ ∑Fi| (4—4)
i=1

式中Fi——每次测量的荧光峰值。

九、荧光池的成套性测试

用校准过的荧光分光光度计进行荧光池成套性的测试。具体操作如下。

置激发波长λem =350nm，发射波长λem =450nm，荧光池中装入1．00×10^-6 g/mL的硫酸奎宁溶液，放入光路时带有标志的一面正对进光方向。将仪器示值调至95％，测量其它各荧光池的示值，凡示值差不大于1．0％的荧光池可以配成一套。

十、光谱仪的探测范围

该指标主要表征检测器性能，一般光电倍增管检测器探测范围在190～870nm，选用InGaAs或Ge探测器后，探测范围可扩展到800～l700nm。

十一、荧光寿命测量范围

荧光寿命测量范围是荧光仪瞬态系统的一个重要参数，根据仪器所用光源及检测器的不同，通常分为微秒级、纳秒级、皮秒级。

十二、氢纳秒灯的稳定性

如果荧光仪配有可测量荧光寿命的氢纳秒灯，它可测寿命的范围是25μs～10ns。纳秒灯的性能测试如下：洗气后充入一定量的高纯氢气，设置灯频率为40kHz，电压7．0kV，激发波长λem =357nm，发射波长λem =357nm，测量范围0～100ns，平均数据采样率小于2000点／s，以分散胶体为样品进行寿命测试，16h后再次测试，比对两次测试结果。

十三、荧光光谱的校正

荧光分析仪使用的好坏除了与荧光分析仪自身的性能密切相关外，仪器的调试工作也起到了决定性作用。因仪器调试工作不到位，测定数据偏差大而无法使用的例子在现实中也时有发生。

由于激发光源在不同波长处发射的光子数存在差异，单色器对各种波长光线的透射率也不尽相同，且与偏振光有关的检测器 (如PMT) 对各种波长的检测效率也不一样。而荧光光谱是测定各个不同波长下的荧光体的荧光强度，这些光学部件的光谱特性的差异无法通过扣除空白溶液的方法消除，所以需要对荧光光谱进行校正。

(1) 激发光谱的校正 以罗丹明B光量子计数器来校正。首先校正零点；然后把罗丹明B-乙醇溶液 (3g／L) 盛入石英三角池，用量为充满石英三角池的2／3容积。将其置入样品室，加入高通滤光片滤去杂散光，仅计6 30nm荧光通过。固定发射波长在630nm，扫描激发单色器 (激发扫描的范围从198．6～601．4nm)，将检测到的信号保存到计算机软件上并进行归一化，得到激发光强度与波长的关系，应为一条与波长无关的直线。移去石英三角池与滤光片，放入分析试样进行激发光谱扫描，即可得到样品已校正的激发光谱。激发波长200～600nm范围内，都可以用此法校正。

(2) 发射光谱的校正 在校正完激发光谱后 (激发光强度已与波长无关)，把扩散体放入样品室，发射波长设定为198．6nm，然后进行激发单色器、发射单色器同波长的同步扫描(扫描的范围从198．6～601．4nm)，将测得的信号保存到计算机软件上并归一化，归一化后的输出信号应为一条与波长无关的直线。移去扩散体，放入试样进行发射光谱扫描，即可得到样品已校正的发射光谱。发射波长200～600nm范围内，都可以用此法校正。

(3 ) 长波长发射光谱的校正 需校正的发射波长处于长波长区600nm甚至更长，副标准光源作为灯源，用它来校正发射光谱的范围在发射波长处于500～900nm范围内。将副标准光源和扩散体放在样品仓内，预热5min，然后进行发射扫描(扫描的范围从498．6～901．4nm)，移去副标准光源与扩散体，放入试样进行发射光谱扫描，即可得到样品已校正的发射光谱。

(4) 长波长激发光谱的校正 在校正完长波长发射光谱后，校正零点，将扩散体放在样品仓内，然后进行激发扫描(扫描的范围从498．6～901．4nm)，移去扩散体，放入试样进行激发光谱扫描，即可得到样品已校正的激发光谱。激发波长500～900nm范围内，都可以用此法校正。

现在某些型号的商品荧光仪在出厂时已经将激发光谱与发射光谱的校正图储存在软件 中，用户在测试时可以根据测试需要直接调出来进行谱图校正，更加简便快速。