荧光分光光度计操作和使用

一、硬件操作

荧光分光光度计在使用时，需要注意开机次序，以保护设备之间不受影响。荧光光谱仪开机顺序一般为先开氙灯，然后开仪器主机，最后开跟仪器连接的计算机。如此操作的原因在于稳态氙灯是高压点亮，为了避免瞬问脉冲电流对周围设备造成影响，需要先开氙灯，等电流稳定后再打开周边的电脑等设备。关机顺序则相反。

二、软件操作

荧光定量分析多采用工作曲线法，即以已知量的标准物质，按试样相同方法处理后，配成一系列标准溶液，测定其相对荧光强度和空白溶液的相对荧光强度；扣除空白值后，以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制工作曲线；然后将处理后的试样配成一定浓度的溶液，在同一条件下测定其相对荧光强度，扣除空白值后，从工作曲线上求出荧光物质的含量。

在用荧光分析法测定某些会引起荧光改变的微量物质时，常采用差示荧光法，可使荧光强度的读数差距拉大，使荧光强度的降低加大，从而提高方法的灵敏度和准确度。
下面以日立F-4500荧光分光光度计的使用为例，具体介绍如何在仪器上进图谱扫描、浓度分析等定性、定量测试操作。

1.图谱扫描(WavelengthScarl)简明操作：

①打开光谱仪电源开关(POwER)，5s后再按下氙灯点灯按钮，当氙灯点燃后，再接通主开关(MAIN)。此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后开计算机、显示器、打印机。计算机进入操作系统。

②运行FL-Solution控制软件。

③建立试验方法(发射光谱)，设置测量参数：点击快捷栏“Method”后，立即显示了分析方法(AnalysisMethod)的五个重叠界面，分别为“常规”(Gen—eral)、“仪器条件”(Instnlinent)、“模拟画面”(Mmlitor)、“处理”(Processing)、“报告”(Report)。

下面详细介绍每个界面：单击“常规”按钮，测量方式选择波长扫描Wave一1ength)；单击“仪器条件”按钮，扫描方式选为发射波长扫描。激发波长的输入范围为200～900nm，发射起始波长的输入范围200～890nm，发射终止波长的输入范围210～900nm。选定合适的扫描速度、延迟时间、发射单元狭缝、光电倍增管负高压，设置发射单元狭缝、响应速度、重复次数等参数。

④进行样品扫描：将待测样品倒人四面通光的石英比色皿中，并将其放入仪器的样品架中。点击测量按钮，仪器便开始对样品进行扫描测量。

⑤存储扫描谱图：在文件菜单“另存为”，输入文件名，按“保存”将数据保存。

⑥打印谱图：打印样品扫描谱图。

⑦测试结束，将比色皿取出，清洗，晾干。退出软件，关闭计算机，在软件上将氙灯熄灭，待其冷却到室温时才关光谱仪主机。

注意：测试结束不要急于关闭光谱仪主机电源。务必等到氙灯冷却后，才关光谱仪主机。可以将手放在仪器主机上面左侧的散热窗口处，感受其温度，直到其温度降到室温时，才能关闭光谱仪主机。

2.浓度分析简明操作

光度计法亦称浓度直读法，也称工作曲线法。利用配制的具有梯度的标准样品，先做出一条标准曲线，然后再反测未知样品。

①打开光谱仪电源开关(PowER)，5s后再按下氙灯点灯按钮，当氙灯点燃后，再接通主开关(MAIN)。此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后开计算机、显示器、打印机。计算机进入操作系统。

②运行FL—Solution控制软件。

③建立试验方法(光度计法)，设置参数：测量方式(MeasureHlent)选择光度计(Photometry)，定量条件：测量类型(Quantitationtype)选择指定波长(Wavelength)，曲线校正类型(Calibrationtype)选择一次线性方程，设置波长数(Numberofwavelengths)、浓度单位(Concentrationunit)。波长方式(Wavelengthmode)：激发波长与发射波长均固定，波长选定后输入具体值。选定合适的发射单元狭缝与激发单元狭缝，设定光电管负高压、重复次数等参数。

标准样品表(Standards)：标准样品数目的设定(Numberofsampies)为1～20间。修订确认(Update)：当标样数确定后，点击此框后显示标样表以供赋值。如果需要临时插入一个标样条目，可点击插入(Insert)键；如果需要临时删除一个标样条目，可点击删除(Delete)键。

④进行样品测量：放入标准样品，点击测量按钮，仪器便开始对标样进行测量。未知样品测量点击F4键，结束测量点击F9键。

⑤存储数据：在文件菜单“另存为”，输入文件名，按“保存”将数据保存。

⑥打印数据。

⑦测试结束，将比色皿取出，清洗，晾干。退出软件，关闭计算机，在软件上将氙灯熄灭，待其冷却到室温时才关光谱仪主机。

3.三维扫描的简易操作

当某个样品不知最佳激发波长和最佳发射波长时，利用该功能可自动快速地给出最佳条件，并可供其它特殊分析用。

①打开光谱仪电源开关，氙灯。

②运行FL-Solution控制软件。

③建立试验方法(光度计法)，设置参数。

a．General(常规)

MeasuremerLt(测量方式)——选择3-DScan方式。

b．Instnlment(仪器条件)

Datamode(数据方式)——可选择Fluorescence荧光或Phosphorescerlce磷光。

ExstartWL(激发起始波长)——200～850nm间选择。

ExendWL(激发终止波长)——200～900nm间选择。

EXsamplinginterval(激发扫描间距)——1～50nm间选择。

EMstartwL(发射起始波长)——200～850nm间选择。

EMendwL(发射终止波长)——200～900nm间选择。

EMsamplinginterval(发射扫描间距)——1～10nm问选择。

Scanspeed(扫描速度)——任选。如为了快速，可选30000nm／min。

④进行样品测量。

⑤存储数据。

⑥打印数据。

⑦测试结束，关机。

三、工作参数条件的选择

1.激发波长的选择

该怎么确定激发波长与发射波长呢?对许多仪器初学者来说，这是个令人感到困扰的问题。如果仪器有三维扫描功能，那就比较简单，放样品进去，按照说明书要求做三维荧光扫描，可以很方便地确定出合适的激发波长与发射波长。如果仪器没有三维扫描功能，一般的方法如下。

首先，将仪器的激发波长（λem）先设定为200nm，然后进行发射(EM)模式扫描，发射波长（λem）扫描范围暂设定为210～800nm，记录所有出现的峰值波长；改变激发波长（λem）后再扫描，如第二次发射图谱中的某个(或某些)峰的位置没有位移(或位移很少)，一般来说这个(或这些)峰就是荧光峰；因为荧光峰的位置是不随激发波长的改变而改变的，仅是峰高(或峰面积)发生改变。

然后，将确定的荧光峰的波长作为发射波长(λem)固定下来，再做激发波长(Ex)的扫描，激发波长的范围要小于发射波长；如果仅出一个激发峰则很简单确立下来，再将这个波长固定下来重新做真正的发射波长(EM)扫描，可以得到具有良好信噪比的结果；如果做激发波长(EX)扫描后出现几个峰，则根据经验来选择，一般应选择峰形、高度适合且有一定带宽的峰作为激发波长。也可以参考荧光光谱的特性——激发光谱与发射光谱呈镜像的特点来确定激发波长。

2.滤光片的选择
在进行发射图谱扫描分析时，根据斯托克斯定律，设置的激发波长要比发射波长短，例如，激发波长λex=260nm，则发射起始波长应该从大于260nm的波长开始，比如270nm，发射结束波长为870nm。这样一来，在激发光的2倍波长(520nm)、3倍波长(780nm)处都会出现激发波长的尖锐的倍频峰，若与荧光光谱峰重叠，将会对测试产生干扰，需选用合适的滤光片将其滤掉。

倍频峰就是激发光的散射峰，虽然波长扫描到双倍波长的时候出现，但实际波长却是激发波长，可以通过增加高通滤光片来去除倍频峰。高通滤光片一般放在发射处，片上都标明其可以滤除的最大波长。也就是说，体系中增加高通滤光片后，比其上所标波长低的光，也包括这些光的二倍波长光、三倍波长光，会被滤掉；而比其所标波长高的光则可以顺利通过。

3.狭缝的设置

荧光强度跟很多因素有关，如分子结构、存在状态、溶液浓度或薄膜厚度、温度、选择的激发波长、测试狭缝宽度等因素。荧光强度在不同仪器上的测量值存在较大差异，不具有可比性，但是其峰位还是较容易确定的，可以用来判断何种物质。进行荧光定量分析，必须固定一些条件。

狭缝的大小对荧光强度很重要，狭缝大小可根据你所测物质的荧光强度大小作出适当的调整。在同一浓度，如荧光强度过大，超过仪器量程，可减小狭缝。但是，需要指出的是，不能仅凭狭缝的大小来改变荧光强度，还要考虑分辨率的问题。对于荧光扫描而言，狭缝加大可以使荧光强度提高同时重现性得到提高，但是分辨率随之降低。狭缝决定分辨率，仪器其它结构已经固定(光栅的刻线数、焦距以及综合的线色散系数)，狭缝大小就决定分辨率的高低。对于实际使用，狭缝大小需要和测定的峰的半峰宽相匹配，过大，峰就变形了。狭缝大小也决定了光通量大小。按照经验数值，狭缝开大1倍，光通量将增大4倍。

4.步长的设置

测量的步长小，测量会慢些，好处足图谱细腻些；步长大，测量速度快，谱图就显得粗糙些。步长设置最好小于需要测量最小半峰宽的1／5，因为步长会与分辨率相关的。原则上，步长应小于3倍的狭缝宽度。

四、测试注意事项

荧光强度容易受外界因素的影响，如样品池、激发光源、温度、溶液的pH值、溶剂性质、其它溶质、表面活性剂等都会造成荧光强度的变化。严格控制测试条件对荧光分析来说至关重要。

①样品应盛在四面透光的石英比色皿(荧光池)中，如果是挥发性样品应使用带塞的荧光池。

②在荧光分析时，为了得到稳定可靠的数据，一般需要开机预热氙灯大约30min。如果仪器光源采用的是闪烁氙灯，预热时间可以缩短到10min左右。对某些易感光、易分解的荧光物质，尽量采用长波长、低入射光强度及短时间光照。

③温度变化可引起荧光强度的改变。通常降低温度，有利于提高荧光量子产率，荧光强度增大。温度影响荧光强度的显著程度因样品而异，大部分荧光物质的荧光强度受温度影响不大，测试温度变化不超过±3℃，对测试结果几乎无影响。

④当荧光物质是弱酸或弱碱时，溶液的pH对荧光强度有较大影响。因为弱酸或弱碱在不同酸度中，分子和离子的电离平衡会发生改变，而荧光物质的荧光强度会因其离解状态发生改变。以苯胺为例：在pH=7～12的溶液中会产生蓝色荧光，在pH<2或pH>13的溶液中都不产生荧光。再如，维生素B2(核黄素)在430～440nm蓝光照射下会发出绿色荧光，λem为535nm。它在pH=6～7的溶液中荧光强度最大，而在pH=11时荧光消失；但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在酸性KMnOt氧化下都会生成荧光强度比维生素B2强得多的黄光素，并可溶于氯仿。利用此性质可提高测定的灵敏度和选择性。

⑤分子结构中存在ππ共轭的荧光物质在极性溶剂中，荧光效率显著增强。溶液表面活性剂的加入能够显著提高荧光强度。

⑥瑞利散射和拉曼散射是溶剂的两种散射光，应注意不要误把瑞利散射和拉曼散射光谱当做荧光光谱。瑞利散射光波长与激发光波长相同，拉曼散射与激发光波长不同，而荧光物质的荧光波长与激发光波长无关，因此可以通过选择适当的激发波长将拉曼散射光与荧光分开。在测试时选择合适的狭缝宽度，或者空白扣除，也可以对散射光的影响进行校正。

⑦荧光物质分子与溶液中其它物质分子之问作用导致荧光强度降低，常见的荧光猝灭剂，如卤素离子、重金属离子、O2、硝基化物质、重氮化合物等。溶液中的溶解氧也能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭现象，因此，在较严格的荧光实验中必须除O2。

⑧测试过程中注意不要肉眼盯着氙灯光源看，以防对眼睛造成损伤。

⑨仪器房应注意经常通风，避免产生的臭氧在室内富集。