用人体干细胞改造猪胚胎，产出人体器官

　　通过把人源干细胞注入经过基因改造的猪胚胎，再将胚胎移殖到代孕母猪子宫内发育3~4周，科学家已经能够培育长着人体器官的猪胎。未来几十年，用动物胚胎生产人类器官或将成为现实，移植器官的来源将不再像今天这样匮乏。

　　每年，全球都有成千上万的人接受器官移植。虽然器官移植技术发展迅速，然而有限的捐献器官数量，却限制了器官移植治疗。全球范围内的数据难以统计，但仅在欧洲，平均每天就有16位需要器官移植的病人在等待心脏、肝脏或者其他器官的过程中死亡，而在美国，这一数字更是达到了22。更令人担忧的是，等待器官移植的病人数量与捐献的器官数量之间的差距，每年都在增加。

　　缓解捐献器官短缺的一种潜在解决方案是，在实验室中生产人类器官的替代品。几年前，科学家认为，可以利用具有祖细胞特性、可分化形成各种不同组织的干细胞，结合人工器官支架，来构建新器官。然而，如何在体外实现对干细胞发育的精确调控，从而获得具有完整功能的人类器官，是研究人员面临的巨大难题。目前关于这方面的研究仍在继续，但是进展相当缓慢。

　　因此，包括我在内的一小部分研究者认为，构建人体器官需要另辟蹊径，即利用胚胎发育的天然机制来实现突破，这一观点也逐渐被越来越多的科学家所认同。不论是小鼠还是人类，胚胎发育演化出一套精确而巧妙的机制，即由少量完全相同的细胞发育分化成不同的器官或组织，最终组装成完整的复杂生物体。动物胚胎的发育出现在受精卵形成后的数周至数月，不依赖人工支架就可生成具有心脏、肺、肾脏及其他功能组织的完整动物。因此，我们相信，能找到一种方法，从猪等动物体内收获器官，供人体使用。

　　当然，一颗正常的猪心脏并不能直接移植给人。首先，人体自身的免疫系统会极力排斥这样一颗完全跨物种的移植物（猪的心脏瓣膜必须经过化学处理，阻断免疫反应后，才能用作人心脏瓣膜的替代物，否则人的免疫系统将破坏整个器官的功能）。我和同事认为，在猪、牛等动物体内，生成完全或者大部分由人源细胞构成的人类器官，是有可能的。这也意味着可能培育出嵌合体动物，即同时由两种不同生物的组分构成的生命体，就像希腊神话中的格里芬（griffin，一种鹰头狮身有翅的怪兽）一样。我们梦想着通过将人源干细胞注入精心改造后的动物胚胎内，待其充分发育成熟，获得包含由人类细胞发育而来的器官的嵌合动物。然后，就可以收获人源的心脏、肝脏或者是肾脏，提供给那些需要器官移植的病人。

　　这种想法听起来有点像天方夜谭，但可行性已经被美国和日本的科学家大体上证实了。研究者将大鼠的干细胞注射到经过改造的小鼠胚胎内，之后将嵌合胚胎移植到代孕小鼠体内，经过数周的妊娠，代孕母鼠生产出外观及行为上均与小鼠无异，却拥有大鼠胰脏的嵌合体动物。我的实验室以及其他课题组的研究人员，已经在此实验基础上开展了进一步研究，即将人源干细胞注射进猪的胚胎中。通过数例干细胞注射实验，我们已经证实，人源组织可以在猪胚胎内发育。然后，我们将嵌合胚胎移植入代孕母猪子宫内，让胚胎发育3～4周。在获得更多的中期实验数据支持后，我们将使嵌合胚胎在代孕母猪子宫内的发育时间延长至数月，那时就可以鉴定出嵌合体胚胎中人源细胞所占的比例。一旦上述实验获得成功，并且美国政府以及地方当局批准我们继续实验，我们预期能够使嵌合胚胎生长到足月（对于猪来说，妊娠期约为4个月）。

　　当然，要最终培育出嵌合体小猪，我们还有很长的路要走。为了让嵌合胚胎安全度过整个妊娠期，我们还需要探索如何制备更好的人源干细胞和更适合接受注射的动物胚胎，整个实验进程将困难重重。然而，即使我们最终未能得到完整的器官，构建嵌合体胚胎的这项研究，也可以帮助我们更好地了解包括癌症在内的很多复杂、毁灭性疾病的发生、发展以及临床表现。如果这项技术获得了成功，将会对器官移植领域产生深远影响。我们将能够在农场动物身上大量生产人类器官的替代品，供给全球成千上万急需器官移植治疗的病人，病人排队等候移植器官的场面将成为过去。

　　跨越物种障碍

　　近几年，生物学家对胚胎的发育机制有了非常深入的研究，我们已经能在一定程度上，对胚胎发育过程进行调控。我们也很清楚，在发育着的生物体内，不同类型的干细胞所在的位置、所处的时间阶段，对胚胎的生长是至关重要的。细胞在胚胎的不同区域会生成、释放不同浓度的生长因子；反过来，不同浓度的生长因子又会激活或抑制特定区域内的遗传程序，进而实现对胚胎发育的调控。基于这些尚不完全的认识，以及大量的实验与摸索，我们和其他一些研究人员希望操控猪的胚胎的发育，让它们长出人的组织，产生肾脏、胰腺等可供移植的器官。

　　我们所用的原材料包括猪的卵子、精子（从猪身上采集），以及人的干细胞（通过实验室培养得到）。我们首先在体外使猪的卵子受精，形成合子（zygote），合子在几个小时后开始分裂成两个细胞，然后再次分裂成看起来完全相同的4个细胞。每个细胞都会激活相同的一些基因，产生一系列蛋白质，诱导细胞进一步分裂增殖。

　　由于基因和蛋白之间复杂的相互作用，这些曾经完全相同的细胞一旦再分裂后，便会开始移动，行使不同的功能。仅仅在几天之内，由受精卵分裂而来的数百个细胞，会形成一个大球套小球的结构，即我们所说的囊胚。这个阶段是我们注射人源干细胞的最晚阶段——也就是说，要在特化组织，即随后会发育为特定功能器官的原基（primordia）开始形成之前注射干细胞。如果再迟一点注射，受体胚胎里原有的干细胞将不能促使外来的人源干细胞发育，人源干细胞最后会萎缩死亡。

　　随着发育的进行，胚胎会形成外、中、内3个胚层，每一个细胞在胚胎上的精确定位变得空前重要。例如，之前的研究已经证明，内胚层的某些细胞会对它们所在的微环境中的蛋白信号作出应答，启动Pdx1基因的表达。而这个基因的表达，又会激活更多基因，促进胰脏的发育。而在中胚层的少数细胞，则会在外部信号的作用下，启动Six2基因的表达，让肾脏开始形成。由此可见，在生物个体中，即使所有细胞的基因组序列一样，但每个细胞在特定发育阶段所处的微环境，决定了细胞会选择性地开启或关闭哪些基因的表达，进而决定这些细胞会发育形成哪些组织和器官。

　　找到像Pdx1或者Six2这样，能够开启一条完整的信号通路，从而控制胰脏或肾脏发育的单个基因，对我们的研究来说非常关键。我们实验室的研究人员通过删除控制胰脏发育的关键基因，培育出了无法形成胰腺的猪胚胎——除非我们向猪胚胎注射了足够多的、含有那种关键基因的人源干细胞。如果注射的人源干细胞能够顺利地在这种猪胚胎内发育，就能在猪体内形成成熟的、完全由人类细胞构成的器官。最理想的结果是，动物的其他部分均由猪的细胞发育而来。

　　由于胚胎发育涉及很多科学问题，要准确删除胚胎中的关键基因，然后用其他物种的干细胞弥补由此产生的缺陷，科学家首先需要在啮齿类动物中做很多实验。2010年，日本东京大学的中内宏光（Hiromitsu Nakauchi）和同事率先取得了突破，他们成功让小鼠长出了大鼠的胰脏。最近，我们实验室将大鼠的干细胞注射进经过基因改造的小鼠胚胎中，让嵌合胚胎在代孕小鼠体内经过3个星期的发育，获得了眼部带有大鼠细胞的小鼠胎儿。

　　选中猪胚胎

　　科学研究的旅程从来不会一帆风顺，需要认真考量所有可能存在的问题。小鼠的体型太小，不可能长出可以移植给病人的器官，所以我们目前的研究重点主要放在猪胚胎上。猪及猪的器官可以生长到不同尺寸，几乎可以满足临床上各种体型的病人的需要。与小鼠相比，猪的妊娠期更长（小鼠妊娠期约20天），但还是短于正常人类胚胎9个月的发育时间。所以研究人员正在探索新的生化方法，拨快人源干细胞发育的生物钟，使其成熟、分化的进程与受体动物胚胎的发育进程相匹配。显而易见的是，将人源干细胞的发育进度调整到与猪胚胎同步，要比调整到与小鼠胚胎同步容易得多。

　　最近，我和同事正在努力构建由人源细胞构成的胰脏或肾脏。选择胰脏或肾脏作目标，是因为这些器官的胚胎发育由单个关键基因控制，删除单个基因相对简单。而像心脏等其他器官，可能需要依靠更多的基因来启动发育进程，这意味着需要敲除不止一个基因，这比敲除单个基因要难得多。让人欣慰的是，最近哈佛大学乔治·丘奇（George Church）领导的科研团队，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在胚胎中成功敲除了位于不同位置的多个基因，这为研究人员对胚胎进行复杂的基因编辑提供了借鉴。

　　另外，我们需要确保用于注射的人源干细胞的“干性”足够好，也就是说，人源干细胞要具有生成任何组织的潜能。生物学家将这种干细胞的生理状态称之为“发育水平上的原初状态”（developmentally naive）。从体外受精的受精卵中获得的人源胚胎干细胞，其干性是符合实验要求的。但是，这种干细胞的应用存在巨大的伦理争议。

　　过去十年里，科学家在干细胞研究上不断突破，iPS技术似乎是解决上述难题的钥匙。iPS即诱导多能干细胞，是通过一些生物技术，让皮肤或是小肠的成熟细胞返回干细胞状态而得到的一种细胞类型。用人源iPS代替人源胚胎干细胞进行试验操作，在伦理上更容易被接受。iPS的另外一个优势是可以制造出与病人在遗传、免疫上完全匹配的器官。

　　然而，深入的研究发现，目前制得的iPS并非处于发育的原初状态，这也是人源iPS无法在嵌合胚胎中存活下来的原因。人源iPS不具备全能性，就不能响应任何来源于胚胎发育过程中的生化信号，不能发育成胚胎需要它们发育成的组织类型。胚胎会将这些不能正确接受胚胎整体调控的iPS视为异己，产生排斥反应。

　　最近，我们实验室的吴军（Jun Wu）独辟蹊径，尝试用一组生长因子来处理人的iPS。处理后的部分细胞，已经可以对来自胚胎发育过程中的很多信号进行应答。目前的初步结果显示，经过处理的人源iPS能够整合到囊胚。我和同事在胚胎发育的不同时间点终止其发育，并在显微镜下观察受体细胞和供体细胞的融合程度。接下来，我们打算让胚胎发育到受精后6周，也就是在可以看到原基的时候再进行观察和分析。到那个时候，胚胎将开始产生最终会发育成动物体各种组织、器官的祖细胞。

　　即使我们能培养出可完全整合进猪胚胎的人源iPS，也不意味着我们成功在望。小鼠和大鼠的嵌合体虽然已经构建成功，但人和猪在进化上相距更远，人和猪的嵌合体也许难以实现。人源iPS也可能无法应答来自于猪胚胎的某些生化信号。如果不能解决这个难题，我们也许就要开始考虑用牛或其他物种来开展试验。

　　监管下的实验进展

　　2012年，我与何塞普·玛丽亚·坎皮斯托尔（Josep Maria Campistol）详细讨论了关于嵌合体生成人类器官的一些问题。坎皮斯托尔是国际知名的器官移植医院——巴塞罗那医院（Hospital Clinic of Barcelona）的院长。对于他的建议，我至今印象深刻，他说：“要想确定人的iPS能否跨越物种障碍，最终在猪的体内发育成人的器官，唯一的办法就是挽起衣袖，进行实验。”

　　坎皮斯托尔的话激励我埋头实践。我们知道单靠自己不可能完成这个艰巨的任务。于是，我们实验室与众多的胚胎学家、兽医、干细胞生物学家以及生物伦理学家成立了一个国际联盟，来一起验证我们的观点。2015年，我们就开始在猪的胚胎里注射人的iPS。在此，我要特别感谢西班牙圣安东尼奥天主教大学（San Antonio Catholic University）以及Moxie基金会对我们早期工作的大力支持，那个时候甚至没有人认为我们的方法是可行的。

　　到目前为止，我们的大部分工作都是在美国加利福尼亚州和西班牙开展的，而且所有的工作都在当地或两国监管部门的监管下进行。现阶段，我们允许猪-人嵌合胚胎在母猪子宫内发育约4个星期，然后我们会处死动物，进行研究分析（根据我们与监管部门制定的协议，代孕母猪和嵌合胚胎需要共同处死）。

　　总之，这些实验以及其他实验获得的数据，帮助我们了解了关于嵌合胚胎发育的一些基础知识。我们正着手研究人源iPS细胞注射到猪胚胎中的最佳数量以及最佳时间。除此之外，我们还开始追踪人源细胞迁移到猪胚胎不同部位的具体路径。

　　几十年后，将成现实？

　　在不断优化实验步骤的同时，研究人员也必须要跟公众一起来处理这个新领域所产生的一些伦理、社会以及监管上的挑战。我们团队与加利福尼亚州还有西班牙的伦理学家、监管部门一起工作了一年半，制定了一系列规章制度来监管我们的实验。

　　毫无疑问，在用任何有感觉的动物进行研究时，我们都应该遵守关于动物福利的相关规定，比如尽量减少动物不必要的痛苦，给动物提供充足的生存空间，保证它们的正常活动等。然而，我们开展的嵌合动物研究，还会面临一些特殊问题。就像前面提到的，真正最原始的干细胞具备发育成任何组织类型的潜能。因此，我们必须要特别关注以下3种组织——神经、精子和卵子，因为在动物体内产生这3种人源组织是任何人都不希望看到的。

　　想象一下，如果猪的大脑充满了大量的人类神经，那么猪将拥有更高级别的感知能力，如果这种情况发生，对我们来说将是一场噩梦。未雨绸缪的做法是注射前将人源iPS中编码神经发育的相关基因删除，这样即使人源iPS在猪胚胎发育过程中迁移到大脑发育的微环境中，它们也不能继续发育。最终，猪的神经必须由猪的细胞发育而来。

　　除此之外，研究人员必须注意的另一个问题是，避免嵌合体动物之间的相互繁殖。虽然可能性很小，但是风险还是存在：我们注射进动物胚胎的人源干细胞不仅会迁移到我们预定器官的发育微环境，也可能进入动物生殖系统的微环境。这种情况造成的后果就是嵌合动物可以产生人类精子和卵子。如果让这些嵌合体动物之间相互繁殖，将会在伦理上造成灾难性的后果：人类的胚胎（由一头嵌合体猪产生的人源精子和另一头嵌合体猪产生的人源卵子结合而成）将会在动物体内孕育。要避免此类麻烦出现，最好的办法就是确保用来生产移植器官的嵌合动物每次都是“重新构建”的，也就是说，每次都用一头猪的卵子和另一头猪的精子体外受精后得到猪的囊胚，再注射人源干细胞。

　　当然，如果技术上的难题我们无法克服，所有这些担忧都属于杞人忧天。但是即使我们不能构建出可供移植的有功能的器官，我相信整个实验过程中探索出来的知识和技术，仍具有巨大的价值。这些知识与技术将首先惠及肿瘤研究领域。研究显示，许多不受控制的肿瘤之所以会在儿童或者成人体内生长，就是因为一些（不是全部）调控胚胎发育到胎儿阶段的基因，在肿瘤组织中被重新激活了。因此，研究人员对胚胎发育的正常细胞信号通路了解得越清楚，就越容易抑制肿瘤细胞的恶性增殖。

　　当然，科学家也是普通人。我们会为科学研究中涌现出的新想法、新技术感到兴奋，也可能对我们研究成果的意义、我们所从事的研究，甚至对整个人类的未来过于乐观了。但是，根据我在本文中所提到的一些前期的研究成果，我确实有理由充满期待——在未来的几十年里，用嵌合体动物胚胎生产人类器官是有可能实现的。