质谱界重磅：继Nature子刊后董梦秋团队又发Nature

　　交联质谱技术（英文全称Chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry, 简称CXMS或XL-MS）；CXMS利用化学交联剂将蛋白质或蛋白质复合体中空间距离足够接近的两个氨基酸通过共价键连接起来，酶切成肽段后用质谱鉴定出交联位点，从而获取低分辨度结构信息，帮助推断蛋白质在三维空间的折叠状态以及蛋白-蛋白相互作用的大致区域。相比于晶体和冷冻电镜技术， CXMS对样品量和样品纯度要求低，可捕获蛋白质在溶液中的动态，并且具有简单、快速等优点。因此，CXMS在过去十年中得到了广泛应用，常常助力解析大型蛋白质复合体的精细结构，以及寻找蛋白与蛋白之间直接相互作用的区域。

　　交联质谱技术有三个支撑点（交联剂、质谱仪器和方法、鉴定软件）和一个原动力（解决实际生物学问题）。当前交联质谱技术的一个明显局限是过分依赖氨基特异性的NHS酯交联剂。此类交联剂主要靶向赖氨酸，得到的结构信息有限，对于缺少赖氨酸的蛋白或蛋白区段，这个缺陷尤其明显。那么为什么不用非特异交联剂如戊二醛呢？这是因为目前的交联鉴定软件还不能有效处理非氨基酸特异性交联。因此，开发针对其他类型氨基酸的新型交联剂成为交联质谱领域亟待解决的科学问题。

　　北京生命科学研究所董梦秋实验室与北京大学雷晓光实验室长期密切合作，开发新型化学交联剂。2016年，两个实验室联合发表了具备富集功能的交联剂Leiker (Tan D, eLife 2016)，2018年发表了靶向谷氨酸和门冬氨酸的交联剂 Diazoker (Zhang X, Anal Chem 2018)。2019 年9月2日，董梦秋和雷晓光团队的最新合作成果在 Nature Communications 杂志上发表，题目为：Improving mass spectrometry analysis of protein structures with arginine-selective chemical cross-linkers 。文章介绍了新型精氨酸特异性交联剂ArGO和精氨酸/赖氨酸双选择性交联剂KArGO的开发和应用。

　　精氨酸是自然界中丰度相对较高的氨基酸之一 (5.2％) ，通常分布在蛋白表面，而且精氨酸是蛋白与蛋白，蛋白与核酸相互作用的热点。因此开发精氨酸特异的交联剂对扩展CXMS的应用具有重要的价值和意义。为了找到在接近生理条件下特异性与精氨酸侧链胍基发生反应的分子，研究人员经过初步筛选，从8种候选官能团中选择了反应条件温和的对-甲氧基苯基乙二醛，并进一步用覆盖到20种氨基酸的多个合成肽段与其反应，结果发现90% 以上的共价修饰都发生在精氨酸上，说明其选择性良好。一系列被称为 ArGO (aromatic glyoxal cross-linkers) 的交联剂也由此诞生。ArGO1-3两端的官能团都是苯基乙二醛，中间为含有1-3个单体单元的聚乙二醇。ArGO1-3在6个标准测试蛋白或蛋白复合体上的表现高度一致，都令人半喜半忧。以ArGO2为例，反应条件优化后在aldolase、BSA 和lysozyme 样品上的交联肽段对鉴定数在 50 以上 ，但GST、lactoferrin 和PUD-1/2却不到30。研究人员为提升ArGO交联效率进行了很多尝试，包括在苯环临、间位加入吸电子或供电子基团、改变交联臂的疏水性，等等，但成效甚微。作者又尝试通过加入高碘酸盐改变反应平衡，从而减少副产物和获得更多的氧化后的主产物，但高碘酸盐的高氧化活性在解决部分问题的同时又引入新的问题，总体依旧没有明显改善。

　　为了可以进一步拓展精氨酸交联剂的使用范围，研究人员决定在ArGO的基础上做一个精氨酸/赖氨酸双选择性交联剂，即ArGO交联剂一端保持原样，靶向精氨酸，另一端换成高效的氨基反应基团，靶向赖氨酸，这样理论上可以让副产物减半。首选的氨基交联基团当然是久经考验的NHS酯，顺着这个思路，研究人员开始进行合成，可是这两个官能团难以兼容，合成出的交联剂在纯化的时候总是遭遇NHS酯被水解的命运，课题又一次陷入了困境。基于2016 年香港大学李学臣课题组报道的用邻苯二甲醛共价修饰蛋白或肽段上的氨基 的工作，研究人员得到了启发，进而设计并合成出一端为苯基乙二醛，另外一端为邻苯二甲醛的新型交联剂，命名为KArGO。大量实验证明KArGO交联剂比ArGO具有更好的交联效果。用6 个标准蛋白或蛋白复合体进行测试，鉴定到的KArGO交联肽段对数目都不低于 50，平均比ArGO交联肽段对多出一倍，在部分样品上与常用的NHS酯交联剂DSS的交联效果相当。因为KArGO产生 K-R 交联，ArGO产生 R-R 交联，NHS酯交联剂产生 K -K 交联，所以三种交联剂捕获的结构信息完全互补，没有冗余。作者进一步将KArGO应用在三个蛋白复合体的结构分析中。KArGO交联结果提示ALPK1 第38位和第40位的精氨酸对ALPK1 的N端和C端结构域的相互作用有重要作用，这是传统的K-K交联剂无法捕获的信息。在CNGP四元复合体上，KArGO提供的分子间交联的结构覆盖度高于ArGO和NHS酯交联剂。在分子量为150 KD 的UtpA五元复合体上，KArGO提供了比NHS酯交联剂更丰富的分子间交联。这些结果清楚表明，KArGO增加了交联剂在蛋白表面可靶向的氨基酸种类而且性能稳定可靠，与赖氨酸交联剂互补，增加交联质谱的结构信息量。

　　在ArGO和KArGO的研发以及文章评审过程中，有一个问题时常出现：对于工具开发，新颖和好用，哪个更重要？新颖对于发表文章的重要性自不必说，人人都想成为第一个。但是对于工具的受众，新不代表好，实际能用而且好用显然更重要。ArGO 并不是第一个靶向精氨酸的交联剂，拔得头筹的是马里兰大学的一个实验室。该实验室研究人员将两个乙二醛基团用一个或两个苯基连接起来作为精氨酸交联剂使用，文章于2008 年发表。但这两个分子太过刚性，得到的交联肽段对很少，从发表至今，未见人真正使用过它。据悉，评审人2 号以此为据 ，批ArGO 和KArGO没有新意，不值得发表。而另外两个评审人看到作者为了让工具实用、好用所做的各种改进和测试，编辑也明确告诉作者“Editorially, we do not share Reviewer#2's opinion on limited novelty.” 所以，这项研究工作的发表让参研人员倍感欣慰：在工具开发上，好用重于新颖的价值观得到了肯定。

　　该文章的三位共同第一作者分别是雷晓光实验室的英国籍博士后Alexander X. Jones博士、董梦秋实验室2015级PTN博士生曹勇以及雷晓光实验室的博士生唐毓良。通讯作者是雷晓光博士和董梦秋博士。其他作者还有：北京生命科学研究所的王建华博士、丁曰和博士、佘杨博士、黄牛博士、邵峰博士、孙瑞祥博士；北京大学的本科生谭惠；中科院计算所的博士生陈镇霖、方润乾硕士、尹吉澧硕士、贺思敏博士；生物物理所的陈荣昌博士、朱星博士、叶克穷博士。

　　亮点：文章首次开发出同时靶向精氨酸和赖氨酸的双特异性交联剂，建立了一套针对该交联剂的稳定的实验流程，在多种蛋白和蛋白复合体上取得了良好的效果。ArGO和KArGO丰富了化学交联剂种类，对扩展交联质谱技术的应用有重要意义。同时曲折的KArGO开发历程也再次证明了坚持才是科研的真谛。

　　原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-11337-z.pdf