脂溶性维生素的测定

　　一、维生素A

　　目前维生素A都是合成的，来源：(1)从动物肝脏中得到;(2)从维生素前体而得到(维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是β-胡萝卜素)

　　维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。

　　对于三氯化锑比色法适用于样品中含VA高的样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维生素A含量低的样品，如每克样品中含5～10μg维生素A时，这时样品由于受其脂溶性物质的干扰，不应用比色法测定。

　　对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，可直接测定维生素A的含量，对样品中含VA低的也可以测出可信结果，操作简便、快速。

　　1、维生素A的性质

　　⑴ 因有许多不饱和链，故见光易分解;

　　⑵ 在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时间长短，因为时间长，见光时间长，见光分解，故测出的比出厂的含量要少;

　　⑶ 对碱稳定;

　　2、测定步骤

　　⑴ 样品用有机溶剂萃取脂类

　　样品可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用热苯回流方法提取脂类。如果样品中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。

　　⑵脂类的皂化

　　脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化(50%KOH、无水C2H3OH、热回流)把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。

　　皂化条件：

　　(1)C2H3OH︰脂类 = 8︰1;

　　(2)KOH量 = 脂量×皂化价(mg)×2.5;

　　(3)皂化温度与时间：70℃、30分钟

　　在皂化时可以加入抗氧剂连苯二酚和对苯二酚，防止氧化。

　　⑶ 提取：不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。

　　⑷ 柱层析分离干扰物质

　　采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把β-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A与β-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。如果样品中只有维生素A而不含β-胡萝卜素时，这时可直接定容。

　　维生素A与β-胡萝卜素分离：

　　吸附剂： 8分中性Al2O3和2分碱性Al2O3混合，装柱

　　分离方法：a. 用2%丙酮石油醚洗β-胡萝卜素;

　　b. 用乙醚洗VA。

　　3、测定方法

　　⑴ SbCl3比色法

　　维生素A/CHCl3 + SbCl3/CHCl3→形成兰色物质→在620nm有最大吸光峰

　　这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。

　　计算：每百克样品含VA的量= C×(V1/V2)×(100/W)

　　C ：从标准曲线上查得VA的量

　　V1 ： CHCl3定容的量

　　V2 ： 测定所取样液体积

　　⑵ 紫外分光光度法

　　a. 原理：

　　VA为脂溶性的，测定VA时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱

　　层析除去杂质等干扰物质，在紫外328nm下测定，求出含量。

　　b. 方法

　　1) 提取及皂化

　　称样10.00g → 于烧杯中 → 加40ml水搅匀 → 移250ml分液漏斗中 → 加氨水5ml → 加乙醇35ml →

　　摇匀 → 用乙醚抽提(每次40ml抽提三次) → 收集乙醚层 → 用10ml水洗乙醚层三次 →水层再

　　用30ml乙醚抽提一次 → 合并所用乙醚 → 用索氏法除乙醚→ 待瓶中乙醚除尽后 → 加30ml80%

　　的KOH → 40mlC2H5OH →加0.8g焦性没食子酸 → 83℃水浴30分钟(皂化脂肪)→ 冷却后移入

　　250ml分液漏斗中 → 加60ml水 → 用40ml乙醚抽提三次 →合并乙醚抽提液 → 用水洗至中性 →

　　用索氏法除乙醚 → 除去后用5ml石油醚溶解瓶中内容物 → 然后移入刻度试管中

　　2)层析

　　在层析柱内装8cm高度中性氧化铝 → 2cm高度碱性氧化铝及1cm无水硫酸钠 → 以石油醚浸透 → 装皂化后的样液慢慢于柱内→ 用1～2ml石油醚洗试管 → 洗液倒入柱内，活塞打开以每分钟为35滴左右的速度打开，当液面降到接近硫酸钠时 → 加5ml石油醚→ 随后用5ml洗脱液逐次洗涤。

　　层析柱上第一个黄色层析层，一般是β-胡萝卜素，此带在12%洗脱液前后洗去，收集于10ml容量瓶中直到流出物不呈黄色为止，此层可测β-胡萝卜素用，而VA一般在50%洗脱液洗出，用2ml刻度吸管收集1ml。吸约0.2ml于小试管中→加0.3ml25%三氯化锑→溶液如呈兰色→表明有VA存在，故0.5ml用石油醚定容10ml。

　　3)样液测定

　　以石油醚为空白

　　4)计算

　　VA(I.μ100G)=(E×106×2)/(1830×100×W)×(1000/0.3)

　　0.3 ：每0.3μg VA相当于1 I.μ

　　E ： 消光值 W ： 样品重量(g)

　　1830 ：石油醚中其消光值1%cm为1830

　　(I.μ)： 一个国际单位，维生素A相当于0.6 μgβ-胡萝卜素。

　　4、试剂

　　⑴ 50%KOH;⑵ 无水硫酸钠;⑶ 乙醚(不含过氧化氢);⑷ 石油醚;⑸ 苯;

　　⑹ 45%C2H5OH(应不含醛类物质)

　　酒精中含醛类的检查方法：

　　首先配银氨溶液，在50%硝酸银溶液中加入浓氨水，直到氧化银沉淀又重新溶解为止，在小试管中加2ml银氨溶液，加3～5滴酒精，摇匀，加10%NaOH 1滴加热，若有银镜反应，表示乙醇中含有醛。

　　脱醛处理：

　　取乙醇2000ml → 加AgNO32g → 振摇溶解 → 加NaOH 4g →振摇溶解 → 过滤 → 上清液 → 蒸馏 → 即可

　　⑺ 20～25% SbCl3的CHCl3

　　先量取100mlCHCl3于广口瓶中，用减差法称取一定量的干燥SbCl3，SbCl3易吸水，所以必需蒸馏重结晶后使用，一般用沙浴上加热。

　　二、维生素D

　　维生素D在鱼肝油和鸡蛋黄等食品中含量较多，一般成人不会缺VD，而婴儿容易缺乏。

　　1、操作步骤

　　⑴ 提取

　　样品(奶粉)+水→混匀 在NH4OH的作用下酪蛋白Ca盐溶解加入乙醇使脂肪球分离→乙醚、石油醚萃取得到脂质(其它样品可用索氏提取得到脂质)

　　⑵ 皂化

　　在奶粉中脂溶性物质有VD、β-胡萝卜素、VA、VE、甾醇、脂肪。

　　目前皂化有三种情况：

　　低温(室温)中温(70℃±2℃)高温(100℃15min)

　　低碱低碱低碱

　　回收率不完全回收率46%回收率70%

　　低碱 = 脂肪︰KOH为1︰2.5的关系

　　另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样，加抗氧化剂的回收率高于不加抗氧化剂的回收率。

　　有人将上面的皂化条件互补，采用中温-高碱并加抗氧化剂，这样的回收率为96.8%，效果较好。

　　故皂化条件 ：70℃±2℃高碱 + 抗氧化剂

　　⑶ 萃取

　　⑷ 除甾醇

　　甾醇在食品中含量较多，主要是通过柱子，这个柱子就是毛地黄皂甙。

　　甾醇 + 毛地黄皂甙 → 沉淀

　　洗脱液用乙醚︰己烷 = 1︰5配制而成

　　甾醇︰毛地黄皂甙 = 1︰14 用量

　　⑸ 皂土柱层析

　　当VD与VA共存时，须用皂土柱层析除VA及VA的分解产物。

　　测定方法有两种：

　　比色法：

　　维生素A/CHCl3 + SbCl3/CHCl3/乙酰氮 → 形成橙黄色物质 → 500 nm下测定

　　紫外分光光度法

　　VD/乙醇 → 265 nm下测定