生物化学实验常用技术:电泳技术

　　带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。如带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向正极移动。电泳技术是生物化学与分子生物学中的重要研究方法之一，利用电泳技术可分离许多生物物质，包括氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷、核苷酸及核酸等，并可用于分析物质的纯度和分子量的测定等。

　　电泳的基本原理

　　许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动。由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及分子量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速度也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。

　　一.泳动度

　　设一带电粒子在电场中所受的力为F，F的大小决定于粒子所带电荷Q和电场强度 E，即 ：F = E•Q

　　根据Stoke氏定律，一球形分子在非真空条件下(例如在溶液中)运动时所受的阻力(F′)与分子移动的速度(v)，分子半径(r)、介质的粘度(η)有关，即：

　　F′ = 6πrηv

　　当 F=F′时，即达到动态平衡时：

　　E•Q = 6πrηv

　　移项得 v/E = Q/ 6πrη (1)

　　v/E 表示单位电场强度时粒子运动速度，称为迁移率(mobility)，也称电泳速度，以μ表示，即：

　　μ = Q/ 6πrη (2)

　　由式(2)可见，带电颗粒的迁移率在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的数量，颗粒大小、形状和介质的粘度等多种因素有关，一般说，所带的净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，则在电场中泳动速度愈快;反之则慢。两种不同的粒子一般有不同的迁移率，在具体实验中，移动速度v为单位时间t内移动的距离d，即：

　　v = d/t

　　又电场强度E为单位距离内电势差U(以伏特计)，L为支持物的有效长度，即：

　　E=U/L

　　以 v=d/t，E=U/L代入(2)式即得：

　　μ = Q/ 6πrη = v/E = dL/tU

　　式中：v为粒子的泳动速度(厘米/秒或分)，E为电场强度或电势梯度(伏/厘米)，d为粒子泳动距离(厘米)，L为支持物的有效长度(厘米)，U为加在支持物两断的实际电压(伏)， t为通电时间(秒或分)。故迁移率(或泳动度)的单位为厘米2·秒-1·伏特-1。

　　某物质(A)在电场中移动的距离为：

　　d A= μA tU/L

　　另物质(B)的移动距离为：

　　d B= μB tU/L

　　两物质移动距离差为：

　　d A- d B = (μA - μB) tU/L (3)

　　式(3)指出物质A、B能否分离决定于两者的迁移率。若它们的迁移率相同则不能分离，有差别才能分离，差别越大，分离越好。当然，也与其他实验条件有关。

　　二.影响电泳的因素

　　电泳结果可受到多种因素的影响，但通常认为以下4个方面更为重要。

　　(一)电场强度

　　电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度越高，则带电粒子的移动越快。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。根据电场强度的大小，可将电泳分为常压电泳和高压电泳，前者电场强度一般为2～10伏特/厘米，后者为20～200伏特/厘米。但电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性，必须有散热措施，才能得到好的效果。

　　(二)介质的pH值

　　介质的pH值决定了带电粒子解离的程度，也决定了该物质所带净电荷的性质和多少。对两性电介质如蛋白质，介质的pH离开等电点越远，所带净电荷越多，则泳动速度亦越快，反之越慢。若在等电点pH介质中，则不能移动。因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个合适pH值，使各种蛋白质所带的电荷量差别较大，以利于彼此分开。通常为保持介质pH的稳定性，电泳都在一定的缓冲液中进行。

　　(三)缓冲液的离子强度

　　缓冲液的离子强度低，电泳速度快，但分离区带不易清晰;离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。如果离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，难维持pH的恒定;离子强度过高，则降低蛋白质的带电量使电泳速度过慢。所以最适离子强度一般在0.05～0.1mol/L 之间。

　　溶液离子强度的计算：

　　I= 0.5ΣCiZi2

　　式中：I为离子强度;Ci为离子的摩尔浓度;Zi为离子的价数;Σ表示"加和"的符号。

　　(四)电渗作用

　　在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗。如在纸电泳中，滤纸中含有表面带负电荷的羟基，因感应相吸而使与纸相接触的水溶液带正电荷，在电场中液体向负极移动，并带动着物质移动。由于电渗作用与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受到电渗影响，如果物质原来向负极移动，则移动更快，反之则慢，所以电泳时粒子表面速度是其本身泳动速度与由于电渗而被携带的移动速度两者的加和。例如，在pH8.6巴比妥缓冲液中进行血清蛋白纸电泳时， γ-球蛋白虽然也同其它主要血清蛋白质一样带有负电荷，应向正极移动，但它却向负极方向移动。这一结果是由电渗作用引起的。选择电泳支持物时，以电渗作用小或几乎无电渗作用的为宜。

　　三.电泳的分类

　　电泳可分为显微电泳，自由界面电泳和区带电泳三种，其中区带电泳操作简便，容易推广，因此常用于分离鉴定。区带电泳又称区域电泳，即电泳在不同的惰性支持物中进行，使各组分成带状区间。区带电泳的形式，仅按某一特点分类似乎都不全面。这里基于支持物的物理性状、装置形式、pH值的连续性等不同，可分为：

　　(一)按支持物物理性状

　　1. 滤纸及其它纤维素薄膜电泳 如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳。

　　2. 凝胶电泳 如琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳，制成凝胶板或凝胶柱。

　　3. 粉末电泳 如纤维素、淀粉、琼脂粉等，将粉末与适当的溶剂调和，铺成平板。

　　4. 线丝电泳 如尼龙丝、人造丝电泳，是一类微量电泳。

　　(二)按支持物的装置形式

　　1. 平板式电泳 电泳支持物(如凝胶)制成水平板状。

　　2. 垂直板式电泳 板状支持物，在电泳时，按垂直方向进行。

　　3.连续—流动电泳 首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，缓冲液和样品自顶端下流，与电泳方向垂直。也可以用其它材料作支持物。该法主要用途是制备一定量的电泳纯物质。

　　4.圆盘电泳 电泳支持物灌制在两通的玻璃管中，被分离的物质在其中泳动后，区带呈圆盘状。

　　(三)按pH的连续性