[实验步骤]由全血直接分选CD3+T细胞

Fab-TACS^® Gravity column 细胞分选重力柱应用实例

• Fab-TACS 技术简介

Fabs-TACS 无痕亲和细胞分选技术（traceless affinity cell selection, Fab-TACS），以 Fab 片段为基础，基于 IBA Lifesciences 独家的 Strep-tag^®/Strep-Tactin^® 蛋白纯化系统，进一步发展而来。Fab-TACS 运用免疫亲和层析的原理，使用细胞表面抗原分子 CD marker 中的 Fab 片段，进行捕捉及释放目标细胞。以不具磁性且可逆的试剂，取代一般具高亲和力的完整抗体，从而达到直接由全血或其他样本，进行温和标准化正选的目的。

Fab-TACS 正选，化解了传统使用完整抗体进行正选的困境，其对目标细胞无不必要的刺激，避免了分选流程的细胞活化，也避免完整抗体与特定受体的结合而影响的分析准确度。因此，使用 Fab-TACS 无痕正选技术可富集不含标记、未激活的目标细胞，次次精准。

• 人全血 CD3+ T 细胞分选实例

1. 所需产品：

(1) CD3 Fab-TACS® Gravity Kit, human（IBA Lifesciences, Cat. no.: 6-6201-004），內含：
	4x Fab-TACS® Gravity column (capacity pro column: 15 ml whole blood) 1x CD3 Fab-Strep, human 1x Buffer CI (10x) 1x Biotin stock solution 1x Fab-TACS® Gravity Adapter Fab-TACS® Flow Restrictor, Pack of 5
(2) Fab-TACS® Gravity Adapter 重力柱适配器
(3) Quadrow 重力柱固定架

2. 样本：含抗凝血剂的正常人全血（建议使用 CPD 抗凝血剂）

3. 实验步驟：

(1) 准备试剂

使用前，所有试剂应置于室温平衡一段时间。

a) 1x Buffer CI：以 dH₂O，将 10x Buffer CI 稀释成 1x 工作溶液

b) Fab-Strep：以 1 ml Buffer CI 溶解 Fab-Strep 冻干粉，之后将 Fab-Strep 分成 5 管，每管 200 µl，不使用的置于 -20 °C 保存。在 1 管 Fab-Strep 溶液中加入 800 µl Buffer CI，静置待用

c) 样本 : 将全血以 3:1 的比例用 Buffer CI 稀释（例：9 ml 全血 + 3 ml Buffer CI），小心的混合均匀。

d) 在 20 ml 的 Buffer CI 中，加入 200 µl 100 mM biotin 溶液，混合后静置待用

(2) 准备重力柱

a) 移除重力柱的盖子，剪去封盖，让保存液排出。将柱子接上适配器后（蓝色圆环），放入试管中（下图 A）、或直接将柱子放置到 Quadrow 上（下图 B）。

b) 以 8 ml Buffer CI 清洗并平衡重力柱。

c) 加入 1 ml 制备好的 Fab-Strep，在 Fab-Strep 完全进入填料后，孵育 2 min

d) 以 2 ml Buffer CI 清洗重力柱即完成。

(3) 细胞分选

a) 上样 : 将稀释后的全血分梯次加入，每次最多 10 ml。收集流过的样本，里面包含未被标记的细胞。

b) 清洗 : 以 10 ml Buffer CI 洗涤重力柱 4 次，收集流出的溶液，是为阴性组分。清洗后填料应转为白色。

c) 洗脱 : 由此步骤开始，流出的溶液包含目标细胞，请使用新的试剂管收集！首先，加入 1 ml 的 biotin 洗脱液，孵育 2 min。其次，加入 10 ml biotin 洗脱液，洗脱目标细胞。

d) 再加入 10 ml biotin 洗脱液，洗下剩余的目标细胞。最后两步骤所收集的液体含分选出的目标细胞。

(4) 结果分析

以下流式图为从 7.5 ml 全血中，选出 CD3+ T 细胞的数据。选后细胞以 CD3-APC（OKT-3） 及 CD45-PE（HI30，白细胞标志） 抗体染色后，进行流式分析，死细胞以 DAPI 染色先行排除，左右分别为分选前后的细胞群分布。

分选前	分选后

总结几次实验的结果，使用 Fab-TACS^® Gravity column 来从全血直接进行 CD3+ T 细胞分选，平均得率为 84.5%，纯度大于 90%，细胞存活率高于 95%，且目标细胞不含标记，贴近天然，使下游实验更精确。