λ噬菌体分离物的快速分析(从液体培养物中纯化λDNA)实验

噬菌体重组子 大肠杆菌

氯仿 乙醇 高盐缓冲液 Tris-Cl NaCl EDTA 异丙醇 低盐缓冲液 酚：氯仿 SM TE TM

NZCYM 培养基 Sorvall SS-34 转子或相当型号 硼硅酸盐巴斯德吸管 Elutip-d 柱 水浴或加热设备 Whatman DE52

一、材料

1. 缓冲液和溶液

氯仿

乙醇

高盐缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.4)，1.0 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)）

异丙醇

低盐缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.4)，0.2 moI/L NaCl，1 mmoI/L EDTA (pH 8.0)）

酚：氯仿（1:1，V/V)

SM

TE ( pH 8.0)

2. 培养基

NZCYM 培养基

3. 离心机和转子

Sorvall SS-34 转子或相当型号

4. 专用设备

硼硅酸盐巴斯德吸管

Elutip-d 柱（Schleicher&Schuell)

预置于 47℃ 的水浴或加热设备

Whatman DE52

5. 载体和菌株

噬菌体重组子，生长于菌苔且完全独立的单个噬菌斑

大肠杆菌，单个的完全独立的生长于平板上的菌落

二、方法

1. 用硼硅酸盐吸管从平板上挑取一个完全独立的单噬菌斑，溶于含一滴氯仿的 1 ml SM 中，于一无菌小聚丙烯管中 4℃ 放置 4~6 h，使噬菌体颗粒从顶层琼脂糖中溶解出来。

2. 在一 25 ml 的离心管中，将 0.5 ml 噬菌体悬浮液（约 3X10⁶ 个噬菌体）与 0.1 ml 过夜培养细菌混匀，37℃ 温育 15 min。

3. 加入 4 ml NZCYM 培养基，37℃ 剧烈振荡培养约 9 h。



4. 在培养物中加入 0.1 ml 氯仿，37℃ 继续剧烈振荡培养 15 min。将裂解物转移至一 5 ml 聚丙烯离心管中，4℃、800 g ( 2600 r/min 于 Sorvall SS-34 转子中）离心 10 min。 

5. 将上清转移至一新鲜的离心管中，经 4℃、4000 g ( 5800 r/min 于 Sorvall SS-34 转子中）离心 10 min 去掉细胞碎片。在这一步可留出小量清亮的裂解物组分作为噬菌体原种溶液，加入小量氯仿后于 4℃ 保存。

6. 取 10 ml 2:1 的 DE52 树脂悬液，转入一新鲜离心管中。室温 500 g ( 2000 r/min 于 SorvaIl SS-34 转子中）离心 5 min 沉淀树脂，去上清后将离心管置于冰浴中。

7. 将 DE52 重新悬浮于清亮的 λ 噬菌体上清中，通过在室温晃动离心管 3 min 使噬菌体颗粒吸附到树脂上。

8. 将 λ 噬菌体上淸/DE52 悬液于 4000 g ( 5800 r/min 于 Sorvall SS-34 转子中）离心 5 min，小心地将上清转移至另一新离心管中，重复离心步骤。每次离心后都去掉沉淀物。

9. 将第二次离心的上清转移至另一新离心管中，用酚：氯仿抽提上清一次，上清中含有 λ 噬菌体颗粒。

10. 将含 λ 噬菌体 DNA 的亲水相转移至一新聚丙烯离心管中，加入等体积的异丙醇。将混合物于 -70℃ 保存 10 min。

11. 4℃、16500 g（12000 r/min 于 Sorvall SS-34 转子中）离心 20 min 收集沉淀的噬菌体 DNA。

12. 倒掉异丙醇，并让残余的也流干。将 DNA 沉淀物风干。

13. 用 2 ml 低盐缓冲液重溶 DNA 沉淀。

14. 用 Elutip-d 柱进行层析以纯化噬菌体 DNA。

15. 在 DNA 洗脱液中加入 1 ml 乙醇，将离心管上下颠倒数次，冰浴 20 min。在微量离心机中离心以去除上清而收集 DNA 沉淀。用 0.5 ml 70% 乙醇冲洗 DNA 沉淀，去上清，然后使 DNA 风干。将 DNA 沉淀溶解于 50 μl TE ( pH 8.0)。